1、0,第14 章 核酸的物理化學(xué)性質(zhì),DNA與RNA的差異（了解）,核酸的物理化學(xué)性質(zhì),核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作為高聚物大分子決定著其物理化學(xué)性質(zhì)。 核酸的糖苷鍵和磷酸二酯鍵：可被水解； 磷酸基和堿基：酸堿性質(zhì)； 堿基：紫外吸收特性； 雙螺旋結(jié)構(gòu)：變性和復(fù)性。 DNA和RNA都微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，提取分離核酸時，可用乙醇將核酸從溶液中沉淀出來。,一、核酸的水解 二、核酸的酸堿性質(zhì) 三、核酸的紫外吸收性質(zhì) 四、核酸的變性、復(fù)性及雜交,核酸的物理化學(xué)性質(zhì),一、核酸的水解,（一）酸水解 糖苷鍵比磷酸二酯鍵更易被酸水解。 嘌呤堿基（DNA，37，pH 1.6）的糖苷鍵比嘧啶堿基（提高溫度，175）的糖苷

2、鍵對酸更不穩(wěn)定。 （二）堿水解 RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸（2-OH基參與反應(yīng)），產(chǎn)生2核苷酸和3核苷酸 。 KOH較好,水解后用HClO4中和，由于KClO4溶解度較小，溶液中大部分K+即被除去。,（1）底物 RNase核糖核酸 DNase脫氧核糖核酸 （2）按作用方式 核酸內(nèi)切酶：作用點(diǎn)在多核苷酸鏈的內(nèi)部 核酸外切酶（5 3外切酶、3 5外切酶） （3）按磷酸二酯鍵斷裂的方式 5磷酸酯鍵 3磷酸酯鍵 （4）其他：雙鏈酶、單鏈酶,非特異性水解磷酸二酯鍵磷酸二酯酶 專一性水解核酸磷酸二酯鍵核酸酶,限制性核酸內(nèi)切酶: 細(xì)菌中，識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種核酸內(nèi)切酶，專門降解外

3、來入侵的異種DNA，對自身無害。,（三）酶水解,一、核酸的水解,二、核酸的酸堿性質(zhì),核酸的堿基、核苷和核苷酸均能發(fā)生解離。在一定的條件下可形成兼性離子，為兩性電解質(zhì)，具有等電點(diǎn)。,三、核酸的紫外吸收,核酸最大吸收峰波長max在260nm處，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。,1、判斷樣品的純度 分別讀出260nm和280nm的A值，計算A260/A280。 純的DNA的應(yīng)大于1.8；純的RNA應(yīng)達(dá)到2.0。 2、對純核酸樣品的定量測定 測出260nm的A值，即可計算含量。,三、核酸的紫外吸收P507,增色效應(yīng)：由于DNA變性，引起的紫外光吸收增加的效應(yīng) 。 減色效應(yīng)：由于DNA復(fù)性，引

4、起的紫外光吸收下降的效應(yīng) 。 原理：雙螺旋結(jié)構(gòu)使堿基對的電子云發(fā)生重疊，減少了對紫外光的吸收。,(一) 核酸的變性 指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。 注意： 變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。 核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變 。 能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高（熱變性）、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。,四、核酸的變性、復(fù)性及雜交P508,DNA的變性過程,驟然冷卻,如何判斷核酸是否變性呢？,熱變性和Tm,螺旋雙鏈開始分開,螺旋雙鏈一半解開,螺旋雙鏈完全解開,DNA的變性過程是爆發(fā)式的，它在很窄

5、的溫度區(qū)間內(nèi)完成。 通常把加熱變性使雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度，用Tm值表示 。 DNA的Tm一般在82-95之間。 RNA有局部雙螺旋區(qū)， Tm較低；tRNA有較多雙螺旋， Tm較高。,DNA的變性在紫外吸收上的變化,影響Tm的因素（了解）： 1.DNA的均一性越高，Tm的溫度范圍越小。例如poly d(G-C)，溶解過程發(fā)生在較小溫度范圍內(nèi)。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，當(dāng)GC的含量上升1%，則Tm上升0.4。 經(jīng)驗(yàn)公式：GC%=（Tm-69.3）2.44 3.介質(zhì)的離子強(qiáng)度較高時, Tm的值較大，溶解范圍小。,DNA制品不保存在極稀的電解質(zhì)溶液中,（二

6、）核酸的復(fù)性,變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性 。 DNA復(fù)性后，許多物化性質(zhì)得到恢復(fù)。 DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)，與DNA自身也有關(guān)系。,四、核酸的變性、復(fù)性及雜交P508,變性核酸復(fù)性時需緩慢冷卻，故又稱退火。 ,復(fù)性時的 初始濃度 重復(fù)序列 拷貝數(shù)等 片段大小,定義：熱變性的DNA在復(fù)性過程中，具有堿基序列部分互補(bǔ)的不同來源的DNA之間或DNA與RNA之間形成雜化雙鏈的現(xiàn)象。 核酸雜交方法是一種分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于檢測DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）。,（三）核酸分子雜交,四、核酸的變性、復(fù)性及雜交P508,Sou