1、PCR實驗室標準化管理與質(zhì)量控制,溫州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院 溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢驗科 陶志華,1,PCR實驗室標準化管理,第一部分,2,一. PCR實驗室的標準化管理,依據(jù)： 按照臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法(衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號文) 臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范 衛(wèi)檢字20028號,3,1. PCR實驗室的設置,工作區(qū)組成 (每區(qū)不同顏色隔離衣) 試劑準備區(qū)、 樣本準備區(qū)、 PCR擴增區(qū)、 PCR產(chǎn)物分析區(qū)、 標本接收及工作區(qū)組成 其設備、儀器等物品專用,4,2. PCR實驗室設置的管理,注意： 唯一流向制度問題 物品的專用與移動問題,5,3. PCR實驗室的人員配置,相對固定的專業(yè)

2、人員（學歷與職稱） 培訓與上崗證 PCR檢測干擾因素較多，結果分析復雜，其應用需要與臨床充分溝通。 PCR實驗室工作人員應掌握相關學科知識及應用能力（實驗技能、分析能力、溝通能力）,6,4. 儀器設備的管理,(1)建檔管理： a. 儀器設備的一般情況 b. 儀器設備的相關文件 c. 儀器設備的損壞，故障，修理記錄 d. 有問題的儀器設備停用標識 e. 儀器設備的報廢處理 (2) 儀器設備的分區(qū)專用 (3) 儀器設備的校準和檢定 (4) 進行定期的維護和保養(yǎng),7,5. 實驗材料的購買和管理,(1) PCR檢測試劑選用: 經(jīng)有關機構檢定批準上市的商品化試劑盒，商品試劑三證齊全（生產(chǎn)許可證、產(chǎn)品注冊

3、證、經(jīng)營許可證）。 (2) Tip頭選購： 必須使用有濾蕊的PCR專用Tip頭,8,b. 內(nèi)包裝檢查：內(nèi)包裝是否有破損，泄漏，內(nèi)容物是否齊全，是否有相應的使用說明書等。,a. 外包裝檢查： 包裝應完整無損無污，標識清楚:廠家名稱，品名，批準文號，生產(chǎn)日期，有效期等。,(3) 試劑及耗材的驗收：,c. 性能檢查,9,a. PCR檢測試劑分區(qū)放置： 核酸提取液，陰、陽性對照、定量標準及其它標本處理用試劑存于樣品處理區(qū)； 擴增反應體系試劑存于試劑配制區(qū)。 b. PCR檢驗試劑存放于-20冰箱。 c. 無菌處理前的耗材存放于試劑準備區(qū)，根據(jù)日常工作量，定期定量處理后放至樣品處理區(qū)和擴增區(qū)。,(4) 試

4、劑及耗材的貯存：,10,體系建立后，如有必要更換試劑品牌，實驗室主任須向科技術負責人提交書面報告說明更改理由；經(jīng)科技術委員會討論，科技術負責人簽字批準方可更換。,(5) 實驗室不能隨意更改檢測體系,11,6. PCR檢測的標本管理,(1) 標本接收 接收標本時應核對標本與檢驗申請單的一致性，對標本狀態(tài)進行登記記錄，并在登記本上簽字。 檢驗申請有不清晰情況時，應即時與臨床科室或相關人員聯(lián)系核實，并做好記錄。,12,(2) 標本的唯一性標識,標識由三部分構成-檢測項目、標本采集日期、該檢測批次的標本序號，三部分間無間隔符號，例如：HBV 02 06 01a1（項目 年 月 日序號）。 標本的唯一性

5、標識須字跡清晰明了，不得隨意作任何涂改；必須時，在舊標識上劃雙線更改，更改后應保持舊標識可辨識,13,(3)標本廢棄處理,廢棄樣本經(jīng)確認后，保持容器完整，置于廢棄標本處，經(jīng)密閉收集，統(tǒng)一焚燒處理,并有記錄。,14,7. PCR試驗記錄的管理,（1）記錄方法 a.接受標本記錄： 以書面形式記錄病人信息、樣本信息、是否 保存，同時對樣本作標識，記錄人簽名； 檢驗時，將標識的樣本帶入樣本處理間處理。 b.PCR擴增檢測記錄： 檢測結果以清楚的唯一標識保存于PCR擴增儀的電腦的指定文件夾內(nèi)，并定期進行備份與整理。,15,c. 保存的文件夾及文件標識號： d. 電子保存的軟件備份要求： 每一個月進行一次

6、電子報告的軟件備份； 安排在每月的最后一個工作日完成。,16,(2) 記錄保存,a.電子數(shù)據(jù)的保存: 將病例資料、樣品資料、檢測結果錄入報告系統(tǒng)，產(chǎn)生報告，同時保存記錄，記錄人簽名 b.書面記錄的保存: 書面記錄（病例資料和結果記錄）裝訂保存于報告系統(tǒng)旁的抽屜里，每月進行整理，所有記錄保存兩年，兩年后交科室統(tǒng)一建檔封存，封存記錄的開啟須經(jīng)科主任同意并委派檔案管理人在場。,17,(3)記錄的保密：,a.“data”由系統(tǒng)設置密碼保護； b. 結果資料在報告系統(tǒng)設置密碼保護； c.在用的及保存的文字記錄須隨時在實驗室工作人員的監(jiān)管下，脫離本室人員視線監(jiān)管的須存放在上鎖的抽屜或文件柜內(nèi)，鑰匙由該工作

7、人員保管。 d. 記錄不能涂改，需修改時可用紅筆在修改內(nèi)容上加雙斜杠并在備注欄中說明、簽字,18,8. PCR檢測結果的報告,(1) 報告的要求 檢測報告應準確、清晰、客觀 (2) 報告的形式各醫(yī)院自定 (3) 報告單的發(fā)放與管理（憑？取單） 電話報告？ (5) 化驗單需郵寄和E-mail形式發(fā)放的管理,19,9. 抱怨的內(nèi)部處理,(1) 抱怨的接受：醫(yī)生、病人、其他人,執(zhí)行者在接受抱怨時，應記錄抱怨者姓名、地址、聯(lián)系方式、抱怨內(nèi)容（必要時首先穩(wěn)定抱怨者情緒）。,20,(2) 抱怨的處理（投訴）,a. 能當時處理的抱怨及時解決，記錄。 b. 不能當即答復的,按逐級授權,匯報解決。 c. 抱怨的

8、處理以病人滿意為目的， 但必須以遵重科學，遵重事實為原則， 在不違背科學原則，醫(yī)療行為規(guī)范的基礎上，爭取抱怨者最大程度的理解。,21,10. 傳染性防護,(1) 來自所有病人的血液和體液都被認為是具有傳染性。標本采集、運送過程中，應保持容器完好，無泄漏。 (2) 處理血液和體液的工作人員都應戴上手套，穿防護服，戴帽子、口罩。 (3) 在標本處理過程中，手或其它部位的皮膚在接觸血液或其它體液后必須立即徹底清洗。,22,臨床基因擴增實驗室質(zhì)量控制,第二部分,23,為什么特別強調(diào)質(zhì)量控制？,容易污染假陽性 處理不當假陰性,24,假陽性問題：,標本、試劑及實驗場地的污染 試劑盒的質(zhì)量問題, UNG酶是

9、一種選擇，但不可因此而高枕無憂 加強管理最為重要 選擇優(yōu)質(zhì)試劑盒,25,假陰性的問題：,原因： 1.標本處理等操作過程問題 2.標本中存在抑制劑 3.由于基因突變所致 解決的辦法： 1.稀釋標本 2.點突變的檢測 3.結合其他方法分析 4.加強與臨床聯(lián)系與對話,26,臨床基因擴增實驗室質(zhì)量控制,為什么強調(diào)質(zhì)量控制？ 目前國內(nèi)所用核酸定量監(jiān)測方法，受模板濃度、PCR反應體系的批間差異影響較大。因此，必須進行方法學的精密度（批內(nèi)變異）和重復性（批間變異）分析，以此來規(guī)范PCR實驗室的室內(nèi)質(zhì)控工作 室間質(zhì)量控制 室內(nèi)質(zhì)量控制,27,臨床基因擴增檢驗的室內(nèi)質(zhì)量控制,測定前的質(zhì)量控制 操作實驗過程質(zhì)量控

10、制 質(zhì)量控制統(tǒng)計學處理,28,測定前質(zhì)量控制,標本采集和留取 實驗室設施、儀器設備及管理 理想的試劑和操作方法 人員培訓,29,操作實驗過程質(zhì)量控制,標本核酸提取質(zhì)量控制 靶核酸提取的質(zhì)量 和效率 臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制物和干擾物質(zhì) 擴增和產(chǎn)物檢測質(zhì)控,30,質(zhì)控管設計,已知弱陽性樣本質(zhì)控 已知陰性樣本質(zhì)控 試劑空白質(zhì)控,31,已知弱陽性樣本質(zhì)控,監(jiān)測整個實驗過程有效性,32,陰性血清樣本質(zhì)控,監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的污染； 由實驗操作所致的標本間的交叉污染； 擴增反應試劑的污染。,33,試劑空白管質(zhì)控,監(jiān)測擴增試劑是否發(fā)生污染，具有較強的污染鑒別性。 監(jiān)測反應液加樣區(qū)及加樣過程

11、是否發(fā)生污染。 如想鑒別實驗室是否發(fā)生污染，可將一個或多個空管打開靜置于標本制備區(qū)3060分鐘，然后加入擴增反應混合液同時以水替代核酸樣本擴增，如為陽性，而上述僅含擴增反應混合液的管為陰性，則說明實驗室以前擴增產(chǎn)物的存在。,34,統(tǒng)計質(zhì)控方法,Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖結合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法,35,高、低值質(zhì)控血清的制備,將常規(guī)檢測的血清標本按高、低值分類后進行混合分裝（每管一個檢測單位），凍存于-20冰箱備用。 購買,36,檢測結果質(zhì)量監(jiān)控,按常規(guī)方法每天插入一份高、低值質(zhì)控血清和陰性質(zhì)控血清進行定量檢測 （包括標本預處理、DNA提

12、取等步驟） 連續(xù)20天后分別計算出高、低值血清的均值（x）、標準差（s）和變異系數(shù)（CV） 制作L-J動態(tài)質(zhì)控圖 高值質(zhì)控血清以強陽性血清為宜 低值質(zhì)控血清以臨界值血清為宜,37,結果,38,結果,39,標準曲線的截距和斜率質(zhì)控,以標準曲線斜率做質(zhì)控圖 以標準曲線截距做質(zhì)控圖 用同批號試劑同批號標準品 連續(xù)檢測20個批次,40,試劑a標記探針熒光強度及背景熒光,41,試劑b標記探針熒光強度及背景熒光,42,試劑c標記探針熒光強度及背景熒光,43,試劑a質(zhì)量結果,我們選擇試劑盒a用于常規(guī)HBV DNA熒光定量檢測，并用該試劑盒標準曲線的斜率與截距對試劑批間差異實施質(zhì)量監(jiān)控，其結果見圖2和圖3。,

13、44,標準曲線斜率與截距的批間差,同批號試劑批間 不同批號試劑批間 斜率 截距 斜率 截距 均值 3.724 45.808 3.671 44.474 標準差 0.116 0.785 0.045 0.952 變異系數(shù) 3.106 1.714 1.229 2.140,45,試劑a質(zhì)量穩(wěn)定性,同批號試劑標準曲線斜率與截距的批間變異（即試劑盒批內(nèi)）為3.106%和1.714%。 不同批號試劑標準曲線斜率與截距的均值、標準差分別為3.671、0.045和44.474、0.952，其批間變異（既試劑盒批間）為1.229%和2.14%。,46,HBV DNA 定量PCR標準曲線斜率質(zhì)控圖,47,HBV DN

14、A 定量PCR標準曲線截距質(zhì)控圖,48,優(yōu)點,采用試劑盒標準曲線的斜率與截距以及熒光背景的噪音和熒光曲線的陡度對其實施動態(tài)質(zhì)量監(jiān)控，具有簡捷、實用等優(yōu)點 利用試劑盒標準曲線斜率與截距對定量PCR進行室內(nèi)質(zhì)控，可有效控制因試劑分裝質(zhì)量(反應液/酶加入量)及酶活性而引發(fā)的失控,49,50,四. 臨床PCR試劑盒的選用,PCR或RT-PCR試劑盒的組成 PCR試劑盒的分類 影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素 PCR試劑盒質(zhì)量指標 PCR試劑盒的選用原則,51,1、PCR或RT-PCR試劑盒的組成,核酸提取試劑 標準品與質(zhì)控品 核酸擴增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴增試劑 產(chǎn)物檢測試劑（有些使用全自動分析儀的PCR方法因其核酸擴增和檢測同時完成，故無專門的產(chǎn)物檢測試劑）,52,2、PCR試劑盒的分類,定性測定： PCR-ELISA、PCR-膜上雜交、熒光PCR（分子信標和Taq Man等） 定量測定： 熒光定量PCR 、PCR-ELISA定量等。,53,3、影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素,內(nèi)在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學設計 外在因素： 試劑盒的運輸和貯存,54,試劑盒的運