1、第三章 細胞生物學研究方法和手段,一、顯微鏡技術 二、細胞的分離及培養(yǎng) 三、細胞組分的分離分離 四、細胞內(nèi)分子的示蹤 五、基本的分子生物學實驗技術,第一節(jié) 顯微鏡技術,光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。 電子顯微鏡：以電子束為光源。,普 通光學顯微鏡,1. 構成： 照明系統(tǒng) 光學放大系統(tǒng) 機械裝置 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。,（一）普通光學顯微鏡,3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 R=0.61 /NA NAsin/2 式中：n=介質(zhì)折射率；=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numeric aperture）。鏡口角總是要小于180，所

2、以sina/2的最大值必然小于1。 思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？,幾種介質(zhì)的折射率,顯微鏡的幾個光學特點： 制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。 sin /2的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.050.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。,熒光顯微鏡 Fluorescence microscope,特點：光源為紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡； 有兩個特殊的濾光片； 照明方式通常為落射式。,Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtub

3、ules in green,用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。,激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細胞樣品的立體結(jié)構。 分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。,laser confocal scanning microscope, LCSM,LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nuc

4、leus (blue),（四）暗視野顯微鏡 dark field microscope,聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。 可觀察 4200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構間的對比度，使各種結(jié)構變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間 相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1

5、/4。,相差顯微鏡,原理,用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標本,偏光顯微鏡polarizing microscope,用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。 光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器 （與起偏器方向垂直的偏振片）。 載物臺是可以旋轉(zhuǎn)。,淀粉,倒置顯微鏡 inverse microscope,物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光裝置。,電子顯微鏡 (Electron microscope),1932年德國學者Max Knolls和Ernst Ruska用波長比光短

6、得多的電子作光源,發(fā)明了第一臺電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率，開拓了超微世界。,電子顯微鏡概述 電子顯微鏡的基本結(jié)構 電子顯微鏡基本結(jié)構由三大部分組成: 電子光學系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、標本室、 成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機等 組成； 真空系統(tǒng)是保持電鏡的真空度； 電子學系統(tǒng)即供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓。,以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。 用于觀察超微結(jié)構（ultrastructure），即小于0.2m、光學顯微鏡下無法看清的結(jié)構，又稱亞顯微結(jié)構（submicroscopic struc

7、tures）。,不同光線的波長,透射電子顯微鏡,透射電子顯微鏡,TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM,掃描電子顯微鏡,20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結(jié)構。工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構有關，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。,Scanning electron microscope（ SEM）,掃描電子顯微鏡原理,電子染

8、色,標本對電子的散射能力取決于其組成 元素的原子序數(shù),原子序數(shù)越高,散射的電 子越多,反差就越大。生物分子是由一些原 子序數(shù)很低的輕元素(氫、氧、碳、氮等) 組成的,它們散射電子的能力很弱,在電鏡 下幾乎不存在明暗反差。為使生物樣品加 大反差,就要進行染色,即用重金屬增加電 子散射能力,稱為電子染色。,電鏡樣品的制備,制樣技術,1）超薄切片 電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。,2）負染技術,用重金屬鹽

9、(如磷鎢酸)對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達1.5nm左右。,Negative Stained Actin,3）冰凍蝕刻 freeze-etching,亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。,A Yeast Cell,第二節(jié) 細胞分離和培養(yǎng),一、流式細胞術,用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。 原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包

10、含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flow cytometer）。,二、細胞電泳,原理：在一定PH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。 各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同 。 用途：檢測細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)、分離不同種類的細胞，如分離哺乳動物的XY精子。,三 細胞培養(yǎng),原代培養(yǎng) （primary culture）：即：培養(yǎng)直接來

11、自動物機體的細胞群，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶，以1：2以上的比例擴大培養(yǎng)，稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。 細胞株（cell strain）：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標志的細胞群。 細胞系（cell line）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細胞，可無限繁殖。 克?。╟lone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。,實驗室中常用的幾種細胞系,Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951, 體外細胞培

12、養(yǎng)的條件 環(huán)境因素 無菌環(huán)境、合適的溫度、一定的滲透 壓和氣體環(huán)境、O2和CO2。后者對于維 持細胞培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。 代謝物和廢物排除：,細胞融合,通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cell fusion）或細胞雜交。 同核體：相同基因型的細胞融合而成。 異核體：不同基因型的細胞融合而成。 自發(fā)融合：同種細胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。 誘發(fā)融合：異種間的細胞必須經(jīng)誘導劑處理才能融合。 誘導細胞融合的方法：生物方法（仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒 ）、化學方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電擊和激光）。,用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程圖,

13、第三節(jié) 細胞組分的分級分離,一、分離細胞亞顯微結(jié)構和大分子的超速離心法,離心技術是分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。 轉(zhuǎn)速為1025kr/min的離心機稱為高速離心機。 轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89K者稱為超速離心機。 目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg。,（一）差速離心 Differential centrifugation,特點： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯度離心

14、再行分離純化。,Low speed,High speed,Differential centrifugation,（二）密度梯度離心,用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。 類型：速度沉降、平衡沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）PH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細胞無毒。,1、速度沉降 velocity sedimentation,用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小

15、于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。,2.平衡沉降 equilibrium sedimentation,用途：分離密度不等的顆粒。 特點： 介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度。 所需的力場通常比速度沉降法大10100倍，往往需要高速或超速離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。,Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation,可以分離蛋白質(zhì)的層析法,又稱色

16、譜法 在本世紀初，俄國植物學家茨維特(MTswett) 將植物色素的石油醚提取液傾入裝滿碳酸鈣顆粒的玻璃管中，再加入石油醚使其自由流下，結(jié)果植物色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的色譜帶。這種方法被稱為色譜法。裝碳酸鈣的玻璃管稱為色譜柱(Column)，管內(nèi)裝的填料(如碳酸鈣)稱為固定相(Stationary phase)，淋洗液(如石油醚)稱為流動相(mobile phase)。,層析法實質(zhì)上是一種物理化學分離方法：即利用混合物中各組分在兩相(固定相和流動相)中溶解、析出、吸附、脫附、或其他親和力和滲透性的差異，當兩相作相對運動時，使各組分在兩相中反復多次受到上述各作用力而得到互相分離。

17、按兩相的物態(tài)分類：用氣體作流動相稱為氣相層析(gas chromatography簡稱 GC)，用液體作流動相稱為液相層析(1iquid chromatography，簡稱LC)。 按固定相所處的形式分類：柱層析、紙層析、薄層層析 按分離過程的物化原理分類：吸附層析法、分配層析、離子交換層析、凝膠層析法、親和層析,離子交換層析 (ion exchange chromatography) 利用固定相球形介質(zhì)表面活性基團經(jīng)化學鍵合方法，將具有交換能力的離子基團在固定相上面，這些離子基團可以與流動相中離子發(fā)生可逆性離子交換反應而進行分離的方法，稱之為離子交換層析。,凝膠過濾層析 利用凝膠層析介質(zhì) (

18、 固定相 ) 交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動相中溶質(zhì)的分子量大小差異而進行分離的一種方法，又稱之為排阻層析。,親和層析 在固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基，這些配基可以與流動相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合而進行分離的一種方法,疏水層析 利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進行分離的方法,金屬螯合層析 利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進行分離的方法,蛋白質(zhì)電泳技術,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：最常用的變性電泳，可以用來測定蛋白質(zhì)分子量。比層析法測定要好。 SDS 與蛋白質(zhì)的疏水部分相合，破壞其折疊結(jié)構，并使其穩(wěn)定地存在于一個廣泛均一的溶液中。 SDS 蛋白質(zhì)復合物的長度與其分子量成正比。由于在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。,SDS-PAGE分離蛋白,等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）電泳,是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等