1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化,2014-12-23,相關(guān)概念 實(shí)驗(yàn)原理 方法特點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)步驟 影響因素,感受態(tài)細(xì)胞 受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的一種細(xì)胞狀態(tài)。 轉(zhuǎn)化 是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。,一、相關(guān)概念,二、實(shí)驗(yàn)原理,化學(xué)方法 CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，其基本原理是：細(xì)胞處于 0 4 的CaCl2 低滲溶液中，大腸桿菌

2、細(xì)胞膨脹成球狀。轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羥基 - 鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng) 42 、90 秒熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收 DNA 混合物。DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)、實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞獲得新的遺傳性狀。常制備的感受態(tài)菌株：DH5、TOP10、DE3、JM109等。 電轉(zhuǎn)化法 電轉(zhuǎn)化法利用瞬 間高壓電脈 沖，使 細(xì)胞表面產(chǎn)生暫時(shí)性 的孔 隙，可在細(xì)胞 膜表 面形成小孔 ，同時(shí) 由于電擊作用可促 使細(xì)胞膜 融 合 ，最后 在細(xì)胞膜上 形成大 的孔 道，易于 DNA 進(jìn)入 。常制備的感受態(tài)菌株：TG1。,化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備,取70冰凍菌種，用劃線法接種細(xì)菌于培養(yǎng)皿，做好標(biāo)記

3、，于37培養(yǎng)過(guò)夜。 第二天，從平板上挑取單個(gè)菌落，接種至含有3ml LB培養(yǎng)液的試管中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 次日取菌液1ml接種至含有100ml LB培養(yǎng)基的500ml燒瓶中，37 劇烈震蕩培養(yǎng)約23小時(shí)（200300r/min）。 當(dāng)菌落600nm OD值達(dá)到0.30.4時(shí)，將燒瓶取出放置冰上1015分鐘。在無(wú)菌條件下把菌液倒入50ml離心管中。4,4000g離心10分鐘。棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養(yǎng)液。 加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中，振蕩混勻，懸浮菌體，冰浴30分鐘。4,4000g離心10分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養(yǎng)液. 加4

4、ml冰預(yù)冷的0.1M的CaCl2，重懸浮菌體。每管0.2ml分裝，至4保存?zhèn)溆茫?448小時(shí)內(nèi)使用效果較好。如果暫時(shí)不用，可再保存于70的低溫冰箱中。,TG1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備,用10ul無(wú)菌槍頭挑取TG1單克隆劃線接種于2YTG板(2YT培養(yǎng)基中加2的葡萄糖)，37過(guò)夜培養(yǎng)。 挑取TG1單克隆到25ml 2YT培養(yǎng)基中，250rpm、37過(guò)夜培養(yǎng)。 早上將搖過(guò)夜的菌液分別取5ml接種于2個(gè)500ml的2YT培養(yǎng)基中，250rpm、37搖到OD6000.6。 下面的操作全部在冰上進(jìn)行： 將搖好的菌液在超凈臺(tái)中分裝到2個(gè)無(wú)菌的500ml 離心杯中，4、3000rpm離心10min。 在超凈臺(tái)中

5、小心倒去上清液，10ml的預(yù)冷10甘油重懸菌體，加預(yù)冷10甘油到總體積500ml。4、3000rpm離心10min。 倒去甘油上清液，10ml的預(yù)冷10甘油重懸菌體，將菌液轉(zhuǎn)到一個(gè)離心瓶中。加預(yù)冷10甘油到總體積500ml。另一個(gè)離心瓶用水平衡。4、3000rpm離心10min。 倒去甘油上清液，10ml的預(yù)冷10甘油重懸菌體，加預(yù)冷10甘油到總體積250ml。另一個(gè)離心瓶用水平衡。4、3000rpm離心10min。 倒去甘油上清液，2.5ml的預(yù)冷10甘油重懸菌體，用無(wú)菌槍頭吸取100ul/管轉(zhuǎn)入1.5ml微量離心管中（離心管作好標(biāo)記且在-80凍存至少半小時(shí)）。馬上用于電轉(zhuǎn)或?qū)㈦x心管馬上放入

6、液氮中，凍存至少1小時(shí)，再放入-80凍存。,各方法特點(diǎn),一般的構(gòu)建重組菌株，化學(xué)法都可應(yīng)對(duì)但在構(gòu)建大容量基因文庫(kù)和抗體庫(kù)時(shí)，必須提高轉(zhuǎn)化效率，采用 電轉(zhuǎn)化 方法是最佳的途徑。,E. Coli的生長(zhǎng)曲線,從 04 h，測(cè)定 E. coli的細(xì)菌濃度(A600nm )，繪制對(duì) 數(shù) 期 生 長(zhǎng) 曲線 (A600nm 1)，如 圖所 示 。 E. coli TG1和 E. coli DH5a的 生 長(zhǎng) 曲 線 均 在 100min后開(kāi)始成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì) ，在10015O min之間， E. coli TG1菌株的生長(zhǎng)速度 比 E. coli DH5a菌 株快。,E.coli DH5a在不同時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率

7、,注：電擊杯間隙為 02 cm,E.coli TG1在不同時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率,注：電擊杯間隙為 02 cm,E.coli 在對(duì)數(shù)期不同時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率探討,選用對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期 的細(xì)胞的感 受態(tài)細(xì)胞是提高電轉(zhuǎn)化效率 的一個(gè)重要的因素。如果選擇沒(méi)有達(dá) 到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或超過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率很低 。對(duì)對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期大腸桿 菌菌株 (A600nm 在 02 10之間)的電轉(zhuǎn)化效率作 了比較 ，通過(guò)E. Coli的生長(zhǎng)曲線圖可 以 看 出 兩 種 菌 株 的 生 長(zhǎng) 趨 勢(shì) 基 本 一 致 ，只 是 在 前 、中 、后期 的持 續(xù) 時(shí) 間 存 在 差 異 。結(jié) 合 E.coli 在不同時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率可 以看

8、 出，在相 同條件下制備的感受態(tài)細(xì)胞 ，大腸桿菌 (Escherichia coli)TG1在 A600nm為 0507之 問(wèn)時(shí)，其轉(zhuǎn)化率明顯高于其它時(shí)期 ；而 Ecoli DH5a 則有兩個(gè)峰值：在 A600nm在 0305之間和 0709 之間，即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期和后期 。并且 DH5a的 最大轉(zhuǎn)化率 比TG1的要高。這是由于菌株大小、形 狀 、細(xì)胞壁 和細(xì)胞 膜組成不 同，導(dǎo) 致對(duì) 相 同強(qiáng) 度 的電 脈沖敏感程度不一樣 ，而且 各時(shí)期 的活 細(xì)胞數(shù)目也 不相同，所以不同菌株在不同時(shí)期的轉(zhuǎn)化效率各異。,質(zhì)粒DNA不同量時(shí)對(duì)E.coli轉(zhuǎn)化效率影響,質(zhì)粒 DNA的結(jié)構(gòu) 、大小 、含量對(duì)電轉(zhuǎn)

9、化效率的 影響也很大。選用 pUC19作為質(zhì)粒材料，就其含量對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響進(jìn)行了探討 ：在 40ul菌液加 入 了 4種不 同含量 的質(zhì) 粒 DNA，分 別 為 0.25 ng、0.5 ng、1.0 ng、1.5 ng，結(jié) 果 表 明 用量 為1.0 ng質(zhì)粒 DNA時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率最高 ，而且電轉(zhuǎn)化 效 率與 外 源 DNA 的含量 在 一 定 范 圍 內(nèi)成 正 比 ；但當(dāng)加入 的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，則會(huì) 使轉(zhuǎn)化效率下降。即 DNA溶液 的體 積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積 的5 %，1 ng的質(zhì)粒 DNA 即可使 50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和 。,電脈沖強(qiáng)度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響,電場(chǎng)

10、強(qiáng)度的影響機(jī)制 較為復(fù)雜 ，目前還 不是 十分清楚。Kimoto的研究表明：電脈沖前 ，DNA和細(xì)胞是隨機(jī)分布 的 ；電脈沖早 期，DNA 和細(xì)胞向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng) ；電脈沖的后期 ，DNA插入細(xì)胞的外膜或者進(jìn)一步進(jìn) 入細(xì)胞質(zhì)問(wèn) 隙；隨后在 37孵 育期 問(wèn) DNA滲透通過(guò) 內(nèi)膜進(jìn)入細(xì)胞漿。高場(chǎng)強(qiáng)下 ，可瞬間擊穿細(xì)胞壁和質(zhì)膜 ，形成能通過(guò)外源物質(zhì) 的跨膜 孔道；而低場(chǎng)強(qiáng)的作用下 ，需累計(jì)電荷達(dá)到一定的強(qiáng)度，才可作用于質(zhì)膜 ，形成孔道 ，這樣易使已形成孔道的細(xì)胞因內(nèi)含物外流而引起死亡 。所以選擇合適的脈沖強(qiáng)度對(duì)外源 DNA的導(dǎo)人非常關(guān)鍵 。,電轉(zhuǎn)時(shí)注意事項(xiàng),1.防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行, 所用器皿,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。 2.感受態(tài)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處在常溫狀態(tài)，會(huì)嚴(yán)重影響到其轉(zhuǎn)化率，因此應(yīng)盡量減少常溫操作，動(dòng)作要迅速。 3.為減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷，操作時(shí)動(dòng)作不能劇烈。