1、吸附層析 分配層析 凝膠層析 離子交換層析 親和層析 紙層析 薄層層析,液 相 層 析 方 法,離 子 交 換 層 析 法,思考題： 離子交換層析的原理？ 離子交換劑由哪三部分組成？它們的結合形式？ 如何判斷蛋白質的電性，如何根據(jù)電性選擇交換劑？ 離子交換層析的操作步驟？ 離子交換層析的應用？,原理：樣品進入離子交換柱后，與離子交換劑無親和力的樣品被洗脫下來，余下的樣品均結合在交換劑上，利用其樣品表面電荷性質的不同，與交換劑的親和力也各不相同，利用不同強度的離子溶液，將其分別洗脫下來達到分離、純化樣品的目的。 離子交換劑通常是不溶于水的高分子物質，分子中含有可解離的基團。,離 子 交 換 層

2、析 法,離 子 交 換 層 析 的 操 作,離子交換劑預處理和裝柱 加樣與洗脫 洗脫餾份的分析 離子交換劑的再生與保存,離子交換層析的應用,生物產(chǎn)物的主要分離純化和分析手段，如氨基酸、多肽及蛋白質，核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子，如多糖等；還可用于水處理。,親 和 層 析 法,是利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離目的的一類特殊層析技術。 具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體、DNA與互補DNA或RNA、酶與它的底物或競爭性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、糖蛋白與它相應的植物凝集素等。,親 和 層 析 法 的 作 用 機 理,固相擔體,(1),(2),

3、(3),A,B,Sample,Washing,Elution,親 和 層 析 的 特 點 及 應 用,親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質尤為有效。 但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應用范圍受到了一定的限制。 主要應用于生物大分子的分離純化。,紙層析法,紙層析的原理？ 紙層析的固定相和流動相分別是什么？濾紙的作用？ 比移值的概念是什么？ 紙層析法對濾紙的要求？根據(jù)Rf值如何選取濾紙 紙層析的操作步驟？ 點樣應選取哪類溶劑，點樣方法是什么？ 展開方式有哪幾種？展開劑的選取原則？ 紙層析法的特點？,紙層析法,紙層析

4、法是以紙作為載體的層析法，分離原理屬于分配層析的范疇。 原理：濾紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動相。有機相流經(jīng)固定相支持物時，與固定相之間連續(xù)抽提，使物質在兩相間不斷分配而得到分離。,紙層析可以看做是溶質在固定相和流動相之間連續(xù)萃取的過程，根據(jù)溶質在兩相間分配系數(shù)的不同而達到分離的目的。 樣品經(jīng)層析后，常用比移值Rf來表示各組分在層析譜中的位置,紙層析的操作,點樣展開顯色分析,樣品溶于適當?shù)娜軇┲?，盡量避免用水； 一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好采用與展開劑極性相似的溶劑，液體樣，直接點樣。,點樣,點樣 先用鉛筆在距紙條一端2

5、 3 cm處劃一條直線（起始線）并在線上隔一定距離劃一“x”號表示點樣位置，見下示意圖：,點樣,點樣工具：微量注射器、毛細滴管(0.5 mm)； 點樣方法：用點樣工具吸取試液輕輕與“x”號接觸，使點樣的斑點直徑為0.2 0.5 cm, 每次點樣2 20 l于濾紙上，以冷風吹干； 原點面積越小越好，每次點樣后原點擴散直徑以不超過23mm為宜； 干后，將紙的兩邊用線縫好，以圓筒形式置于層析缸中展開。,展開,展開劑由一種或多種溶劑按一定比例組成。 展開劑的選擇： 待分離物在兩相中的溶解度 展開劑的極性 展開劑與待分離物間應無化學反應 待分離物在展開劑中的分配系數(shù)最好不受溫度的影響 待分離物在兩相間的

6、分配平衡瞬間達到,展開,常用展開劑：水飽和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有機酸、有機堿，有時也加入一定比例的無機酸、無機堿、甲醇、乙醇等。 展層方法：展層前，層析缸與已點樣濾紙必須予先經(jīng)水蒸汽、溶劑蒸氣飽和。 展開方式：上行法、下行法、環(huán)行法、雙向展開法。,上行法,將點有試樣的濾紙條的下端浸入溶劑（但不能浸沒點樣處），上端固定在層析缸的上部，保持垂直，將缸密閉，使溶劑沿下端上升而展層。待溶液上升到距離紙上端3 4 cm 時，將濾紙取出，用鉛筆在溶劑前沿處畫線作記號。,玻片,玻璃棒,原點,玻皿,剪成鋸齒狀，便于溶劑滴下,下行法,溶劑自紙的上端向下降(借助于重力的作用)，具

7、有分離速度快及連續(xù)揮發(fā)色譜的優(yōu)點。,取圓形濾紙在直徑的兩邊各畫兩根平行線，用剪刀沿這兩根線剪至圓心處，在紙的中央滴上試液。 是一種既快又方便的方法。,環(huán)行法,用一種溶劑不能將組分分開時，可試用該法。,若前后二次展開劑選擇適當，可使各種組份完全分離。例如，氨基酸的分離可用此法。也可以二次使用同一種展開劑展層。,雙向展開法,展層后，取出濾紙，用鉛筆在溶劑前沿作記號。 有色物：直接觀察各個色斑 無色物： 物理法顯色：用紫外燈照。 化學法顯色：噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。,顯色,定性：根據(jù)物質的Rf，為了查明未知物的組成，在同樣條件下與已知的純物質做對照實驗。 定量 剪洗法 比較法：制標準系列圖譜

8、，與待測斑點顏色、面積進行比較，確定其可能的含量。,分析,紙 層 析 的 應 用,在染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機酸堿類化合物、糖類化合物、氨基酸、蛋白質及中草藥中有效成分的分離分析中經(jīng)常被使用； 用于無機離子的分離； 作為高效液相色譜的一種預試方法。,思考題,用紙色譜法分離A、B兩種物質，在某條件下兩物質的比移值分別為0.36、0.40。設A、B兩物質斑點的直徑分別為0.2 cm,0.4 cm,當展開劑的前沿達到10 cm時，A、B能否完全分離? 用紙色譜法分離A、B兩種物質，在一定條件下A、B兩物質的比移值分別為0.35,0.45，設A、B兩物質色譜斑點的直徑分別為0.50cm和0.80cm,要求

9、展開劑前沿至少達到多少厘米時，A和B才能完全分離?,第一題,設A、B兩物質色譜斑點的中心距原點分別為 x1、x2cm，則 x1/10 = 0.36 x2/10 = 0.40 x2-x1 = (0.40-0.36)10 = 0.4(cm) 欲分離兩物質，兩斑點中心距離至少為 (0.20+0.40)/2 = 0.30cm, 而實際兩斑點中心距離為0.4 cm , 故在此條件下A B兩物質可得到完全分離。,第二題,設x1, x2分別為AB兩物質斑點距原點的距離： 則 x1/y=0.35 x2/y =0.45 x2-x1=0.40+0.25=0.65 又 x2-x1=(0.45-0.35)y =0.6

10、5 故y =6.5(cm),薄 層 層 析 法,層析法中應用最普遍的方法之一； 它具有分離速度快、展開時間短、分離能力強、斑點集中的特點； 靈敏度高，通常幾至幾十微克的物質，即可被檢出； 顯色方便，可直接噴灑腐蝕性顯色劑，如濃硫酸等，也可在高溫下顯色。,薄 層 層 析 的 操 作 方 法,薄層層析的一般操作程序： 制板 點樣 展開 顯色 分析,點 樣,展 開,薄層的展開需在用展開溶劑予先飽和的密閉器皿中進行，展開方式和紙層析相同。但不加粘合劑的薄板只能作近水平式（與平面成20 10角）而不能垂直展層。,顯 色,有色溶液 ：直接將樣品色斑與標準色斑移位的距離 作比較 。 無色溶液 被紫外線激發(fā)顯

11、熒光的物質 ：直接在紫外燈下觀察熒光斑點。 不顯熒光 ：在吸附劑中滲入少量熒光性物質。 化學顯色：噴霧法、薰蒸法。,噴 霧 法,薄 層 色 譜 的 定 性、定 量 方 法,定性分析：顯色后，顯出原點到斑點中心和原點到溶劑前沿的距離后，計算Rf值，然后與文獻記載的Rf值比較以鑒定各種物質。 定量分析 直接在薄層板上測量斑點面積的大小或比較顏色的深淺，與標準品比較作為半定量。 洗脫定量法,分 離 方 法 的 選 擇,氣相色譜法 （Gas Chromatography GC） 特點 分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快等。主要用于中藥制劑中揮發(fā)油及其他揮發(fā)性組分，及水分、乙醇、甲醇和農(nóng)藥殘留量

12、的測定。但本法對揮發(fā)性差或遇熱易分解破壞的物質難以分析。 分類 1.按固定相狀態(tài)分類：氣固GC、氣液GC 2.按分離原理分類：吸附GC、分配GC 3.按色譜柱分類：填充柱GC、毛細管柱GC 后者分辨率高（n10 ）常用于農(nóng)殘分析,儀器及其工作原理 工作原理 加熱分析樣品使其氣化，由載氣帶入色譜柱，由于各組分在固定相與載氣間分配系數(shù)不同，經(jīng)分離依次被載氣帶入檢測器，將各組分的濃度或質量轉換成電信號并記錄成色譜圖，根據(jù)峰高或峰面積進行定量分析。,N2,H2,空氣,色譜柱,進樣器,FID,記錄儀,電流 放大器,氣相色譜儀,氣路系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),

13、組成部分：,2. 進樣系統(tǒng) 進樣系統(tǒng)的作用是將液體或固體試樣，在進入色譜柱之前瞬間氣化，然后快速定量地轉入到色譜柱中，進樣的大小，進樣時間的長短，試樣的氣化速度等都會影響色譜的分離效果和分析結果的準確性和重現(xiàn)性，包括： （1）進樣器 （2）氣化室：為了讓樣品在氣化室中瞬間氣化而不分解，因此要求氣化室熱容量大，無催化效應。,3. 分離系統(tǒng) 分離系統(tǒng)由色譜柱組成。有填充柱和毛細管柱兩類。 (1) 填充柱 由不銹鋼或玻璃材料制成，內(nèi)裝固定相，一般內(nèi)徑為2 6mm，長0.5 6 m。填充柱的形狀有U型和螺旋型二種。 (2) 毛細管柱 內(nèi)徑一般為0.1 0.5mm，長度20 300m，呈螺旋型。,毛 細

14、 管 柱,色譜動力學理論認為，氣相色譜的填充柱在運行中存在嚴重的渦流擴散，影響柱效的提高。 1957年Golay由它的理論發(fā)明開管柱，它是一根內(nèi)徑0.1-0.5mm，長度為 10-300m的毛細管柱，每米理論塔板數(shù)為2000-5000，總柱效最高可達106。 可分析復雜有機混合物，如石油成分、天然產(chǎn)物、環(huán)境污染、生物樣品。,毛細管柱與填充柱的比較,毛細管柱與填充柱色譜儀主要部件比較,4. 檢測系統(tǒng) 濃度型檢測器 測量的是載氣中組分濃度的瞬間變化，即檢測器的響應值正比于組分的濃度，如熱導檢測器（TCD）、電子捕獲檢測器（ECD）。 質量型檢測器 測量的是載氣中載氣中組分的質量流速的變化，即檢測器

15、的響應信號正比于單位時間內(nèi)組分進入檢測器的質量，如氫焰離子化檢測器（FID）和火焰光度檢測器（FPD）。,熱導監(jiān)測器TCD(Thermal Conductivity Detector),氫火焰離子化監(jiān)測器FID(The Flame Ionization Detector),電子捕獲檢測器: ECD(Electron capture detector),火焰光度檢測器: FPD(Flame photometric detector),高效液相色譜法(HPLC),高效液相色譜法概述 高效液相色譜儀的結構 高效液相色譜法的主要類型有選擇,現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜,HPLC是在經(jīng)典色譜的基礎上發(fā)展起

16、來的； 現(xiàn)代液相色譜將流動相改為高壓輸送，色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬），同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測； 高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點，故稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。,液相色譜與氣相色譜的比較,相同點： 液相色譜所用基本概念保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致； 液相色譜所用基本理論塔板理論與速率方程也與氣相色譜基本一致。 不同點：,高 效 液 相 色 譜 儀,高效液相色譜儀由 高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄系統(tǒng) 等五大部分

17、組成。,一、高壓輸液系統(tǒng) 由于HPLC所用固定相顆粒極細，對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備； 一般由貯液器、高壓泵、梯度洗脫、脫氣裝置和壓力表等組成； 貯液器要惰性、耐腐蝕，配有過濾器； 高壓泵應密封性好、輸出流量穩(wěn)定、壓力平穩(wěn)； 梯度淋洗通過連續(xù)改變流動相極性、離子強度等使保留時間過短而峰形重疊，或過長峰形扁平寬大的組分，都獲得良好的分離； 脫氣采用氦氣鼓泡驅除流動相中溶解的氣體。,(1)流動相貯存器,流動相中氣泡？,原因 危害 脫氣,超聲波振蕩；惰性氣體鼓泡吹掃脫氣；真空脫氣。,流速 不穩(wěn)、基線 起伏、噪音峰 尖銳、檢測器問題,氧氣、空氣,在線真空脫氣和He脫氣對保留時間再現(xiàn)

18、性的影響,(2)輸液泵,基本要求 1 流速穩(wěn)定 2 流量可調(diào) 3 耐高壓 4 死體積小 5 耐腐蝕,(3)梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。,內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,二、進樣裝置 柱較短，能由進樣系統(tǒng)、連接管道等存在的死體積引起柱外展寬，故進樣技術要求高，有兩種： 注射器進樣 具有快速、簡便、可任意改變進樣體積等特點，但進樣體積不宜過大，進樣重復性欠佳，試樣易滲漏； 六通閥進樣 由閥芯、閥體、定量管組成，特點為進樣量由選定的定量管而固定，重現(xiàn)性好

19、。,2 進樣裝置,耐高壓的六通閥進樣裝置,三、分離系統(tǒng) 分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件； 色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成，其內(nèi)徑為2 6mm，柱長為10 50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相； 柱溫一般為室溫或接近室溫。,3 高效分離柱,柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,高效液相色譜法的主要類型,液固吸附色譜法 液液分配色譜法 化合鍵合色譜法 離子色譜法 分子排阻色譜法,四、檢測器 檢測器是HPLC的三大關鍵部件之一，但至今乃是一個薄弱環(huán)節(jié)；按適用性分兩類： 通用型檢測器對大多數(shù)物質的響應差別不大，適用于所有物質的

20、檢測，如示差折光檢測器等； 選擇性檢測器對不同組成的物質響應差別極大，只能選擇性地檢測某些物質，如紫外檢測器、熒光檢測器等。,液相色譜檢測器,a. 紫外檢測器 應用最廣，對大部分有機化合物有響應。 特點：靈敏度高； 線形范圍高；流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。,b. 光電二極管陣列檢測器,紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,c. 示差折光檢測器（differential refractive index detecto

21、r）,除紫外檢測器之外應用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；,通用型檢測器（每種物質具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉式、反射式和干涉型三種；,酶聯(lián)免疫分析法(ELISA),六十年代出現(xiàn)的新的免疫測定技術，當時主要用于臨床診斷，如檢測藥物、蛋白和病毒，經(jīng)過三十多年的不斷改善和完善，已成為一種不可替代的普遍運用的分析法。 該分析法在臨床診斷上的巨大成功，引起許多食品分析家的興趣，并于七十年代末將該方法用于食品衛(wèi)生分析的研究和應用。,ELISA是把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機的結合起來的一種檢測技術。 其主要依據(jù)有三點： 抗原(抗體)能結合到固相載體的表面仍具有其免疫活性； 抗體(抗原)與酶結合所形成的結合物仍保持免疫活性與酶的活性； 相應的抗體(抗原)反應后結合的酶仍能催化底物生成有色物質，而顏色的深淺可定量抗體(抗原)的含量。,