1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作,.,目錄,CONTENTS,.,載體及相關(guān)工具,.,載體簡(jiǎn)介,注: 此慢病毒質(zhì)粒載體的全長(zhǎng)8860bp。由多種功能元件組成，其中包括5端和3端的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、整合信號(hào)及多聚腺苷化信號(hào)等調(diào)控序列；CMV啟動(dòng)子能夠在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)外源基因的作用，同時(shí)能驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白（eGFP）報(bào)告基因eGFP ，可用于感染效率的檢測(cè)；穩(wěn)定篩選標(biāo)記嘌呤霉素抗性基因Puromycin；復(fù)制起點(diǎn)pUCori以及氨芐青霉素抗性基因Amp組件等。,.,相關(guān)工具準(zhǔn)備,玻璃毛細(xì)吸管（移卵針）制作： 1雙手持毛細(xì)玻璃管，將其中部在酒精燈上進(jìn)行燒灼加熱，當(dāng)玻璃管中部變紅并充分

2、軟化時(shí)，從火焰上離移開并快速向兩側(cè)外拉。2在火焰上將拉長(zhǎng)后的毛細(xì)玻璃管燒斷，形成兩均等的毛細(xì)吸管。3用安瓶切割砂輪切斷毛細(xì)玻璃吸管，留10cm 長(zhǎng)左右。4在酒精燈上微微加熱毛細(xì)吸管，使其頭部吸口微縮、光滑。注意，過熱的溫度可能使吸口封住。,.,移卵針,.,結(jié)扎雄鼠,5%苯巴比妥鈉2.4ml麻醉6周以上的ICR雄鼠（腹腔注射）； 腹部向上呈仰臥狀，剪凈手術(shù)部位被毛，75%酒精從內(nèi)向外消毒手術(shù)部位； 剪開約1cm切口，分離皮膚、肌肉層； 找到輸精管，用絲線結(jié)扎輸精管兩端，剪斷輸精管，用鈍頭鑷子將整個(gè)器官送回腹腔； 相同的方法處理另一邊輸精管； 依次縫合肌肉層及皮膚切口。,.,結(jié)扎雄鼠,.,結(jié)扎雄鼠

3、,.,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指將特定的外源基因?qū)雱?dòng)物受精卵或胚胎，使之穩(wěn)定整合于動(dòng)物的染色體基因組并能穩(wěn)定遺傳給后代的一類動(dòng)物。 根據(jù)外源基因?qū)氲姆椒ê蛯?duì)象的不同，目前制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法主要有顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒法、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)法、電脈沖法、精子載體導(dǎo)入法等。,.,操作流程圖,供體鼠超排,與種公鼠合籠,取胚,顯微注射,胚胎移植,F1代檢測(cè),提取質(zhì)粒載體,病毒包裝,受體鼠與結(jié)扎鼠合籠,.,供體鼠超數(shù)排卵法,PMSG（孕馬血清促性腺激素）和HCG（人促性腺激素）間隔48h腹腔注射，促進(jìn)供體母鼠（B6，6-8周）排卵； 注射后與

4、種公鼠（B6，6-8周）合籠交配； 同時(shí)將發(fā)情受體母鼠（ICR，6-8周）與結(jié)扎過的公鼠（ICR,6-8周）合籠交配，制作假孕母鼠模型； 檢查陰栓，見栓表示交配成功，準(zhǔn)備下一步處理。,.,.,檢查陰栓,.,取胚胎,頸椎脫臼處死供體母鼠，打開腹腔，取輸卵管壺腹部，置于M2培養(yǎng)液*中； 在體視顯微鏡下，與M2培養(yǎng)液*中用眼科鑷撕開壺腹部，可見釋放出來的受精卵； 用事先準(zhǔn)備的移卵針吸取受精卵置于新鮮M2培養(yǎng)液中清洗3-4次； 放置于37，5%CO2培養(yǎng)箱中待用。,* 為M2培養(yǎng)液中加入了透明質(zhì)酸酶,.,.,.,顯微注射,凹形載玻片,礦物油,M2培養(yǎng)液,.,顯微注射,.,顯微注射,調(diào)節(jié)持卵針、注射針和

5、受精卵細(xì)胞,使之處于同一焦聚平面； 持卵針減壓吸住受精卵，含有病毒懸液的注射針分別從受精卵上極、下極以及中軸線3個(gè)角度刺入透明帶進(jìn)入卵周隙； M16培養(yǎng)液培養(yǎng)并觀察存活率和分裂情況。,.,顯微注射,.,胚胎移植,取見栓的假孕母鼠，麻醉，在背部輸卵管壺腹部處開口，暴露出膨大的壺腹部； 用移卵針先吸取一些M2培養(yǎng)液，后吸入一個(gè)小氣泡，再吸入含有受精卵的M2培養(yǎng)液，再接著做一個(gè)小氣泡，吸取一小段M2培養(yǎng)液； 用組織鑷夾住卵巢上的脂肪堆，將卵巢、輸卵管及子宮網(wǎng)上拉出體外，在體視顯微鏡下找到膨大的壺腹部，用眼科鑷固定好壺腹部，后用尖利的針頭在靠近卵巢的膨大的壺腹部前刺開一個(gè)小口； 用移卵針插入小孔，輕輕吹出受精卵直到2個(gè)氣泡完全進(jìn)入輸卵管； 將臟器放回腹腔，縫合。做完移植手術(shù)的小鼠放回籠子，保溫37直到清醒。,.,.,.,.,M2培養(yǎng)液,氣泡,含受精卵的M2培養(yǎng)液,M2培養(yǎng)液,受精卵,移卵針氣泡位置圖示,.,觀察F1代基因表達(dá)情況,代孕母鼠產(chǎn)下F1代后，待F1代沒有長(zhǎng)出被毛之前，可用藍(lán)光手電筒檢測(cè)小鼠全身有無綠色熒光表達(dá)，有則表示外源基因隨著載體轉(zhuǎn)入成功； 待F1代離乳后（一般在出生后21天），可剪一小段鼠尾，提取組織中的DNA，利用