1、第二章 天然藥物化學成分的提取、分離、鑒定方法,第一節(jié)天然藥物化學成分的 提取方法,提取用適當?shù)姆椒ê图夹g將天然藥物中的化學成分從組織細胞中抽提出來的過程。 主要有：溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、升華法等,一、溶劑提取法,根據(jù)被提取成分的溶解性質(zhì)，選用合適的溶劑和方法將天然藥物中的化學成分溶解出來。,3. 擴散（溶液）,1.溶劑滲透,細胞膜,2.溶解內(nèi)容物、產(chǎn)生濃差,溶劑法提取示意圖,（一）.溶劑的選擇 溶劑按極性可分為三類： 親脂性有機溶劑：石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯 正丁醇 親水性有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮(與水混溶） 水 常用于中藥成分提取的溶劑如下： 極性：小 大,石油

2、醚Pet苯C6H6氯仿CHCl3乙醚Et2O乙酸乙酯EtOAc正丁醇n-BuOH 丙酮Me2CO乙醇EtOH甲醇MeOH H2O,選擇溶劑的原則 相似相溶 相似相溶極性大的化學成分易溶于親水性溶劑，極性小的化學成分易溶于親脂性有機溶劑。 極性判斷依據(jù)： a、分子大?。夯鶊F一樣，分子大，極性小 b、基團的性質(zhì)與數(shù)量：極性基團多則極性大。 極性基團：-COOH、 、OH、 NH2 中等極性基團：OR、 COOR 非極性基團：烷基 理想溶劑：對有效成分溶解度大，無效成分溶解度小，與植物成分不起化學反應；安全、成本低；,一般情況下： 石油醚可提出 油脂、蠟、揮發(fā)油、游離的甾體及萜類； 氯仿或乙酸乙酯可

3、提出 游離生物堿、有機酸、黃酮及香豆素等； 丙酮、乙醇、甲醇可提出 苷類，生物堿或有機酸鹽類、鞣質(zhì)等； 水可提出 糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、無機酸鹽等類水溶性成分。,（二）.提取方法（操作） 1、煎煮法：水作溶劑熱提 優(yōu)點：溶劑易得，簡便，大部分成分可被不同程度地提取出來（助溶作用）。 缺點：揮發(fā)性成分和受熱易破壞的成分不宜使用； 含多糖類化合物煎煮后藥液粘度較大，難以過濾。,2、浸漬法： 優(yōu)點：遇熱易破壞、揮發(fā)性成分和含淀粉或粘液質(zhì)多的成分適用。 缺點：提取時間長，效率不高； 以水為溶劑時，應防霉變質(zhì)。 3、滲漉法： 優(yōu)點：可保持濃度差，提取效 率高，節(jié)約溶劑。 缺點：操作較麻煩。,4、回流提取

4、法 有機溶劑熱提取 優(yōu)點：提取效率高，溶劑消耗較少。 缺點：受熱易破壞的成分不宜使用。,5、連續(xù)回流提取法： 優(yōu)點：溶劑消耗量小，提取效率高。 缺點：對熱不穩(wěn)定化學成分不宜使用。,索氏提取器,（三）影響提取效率因素 溶劑的選擇 提取方法 藥材粉碎度 2060目 提取時間 水加熱12小時（分2-3 次），乙醇加熱每次1小時 提取溫度 不宜過高 溶劑用量、提取次數(shù)等。,提取方法,使用范圍及特點,二、水蒸氣蒸餾法 本法適用于提取能隨水蒸氣蒸餾，而不被破壞的難溶于水的成分。 這類成分在100時有一定蒸汽壓, 沸騰時,該類成分隨水蒸氣一并帶出,再用油水分離器或有機溶劑萃取法,將這類成分自餾出液中分離.如

5、中藥揮發(fā)油的提取常采用此法。根據(jù) 原理：道爾頓分壓定律 即： P=PA+PB P總蒸氣壓；PAA物分壓；PBB物分壓 當 P =大氣壓時則沸騰,總混合液體bp. 混合物中沸點最低物質(zhì) 例： 沸點 混合后沸點 水 100 760mmHg 69.25 苯 80.1 760mmHg （1）混合物的沸點比任一單一液體的沸點低； （2）沸點高的可較低溫度下被水蒸氣蒸餾出來。 水蒸氣蒸餾法操作、設備均教簡單。,三、超臨界流體萃取法(SupercriticalFluid Extraction-SFE) 超臨界萃取法是一種集提取和分離于一體,又基本上不用有機溶劑的新技術。 SF是在臨界溫度和臨界壓力以上介于氣

6、體和液體之間的流體。SF同時具有液體和氣體的雙重特征，它的密度與液體相似，粘度與氣體相近，擴散系數(shù)雖不及氣體大，但比液體大100倍。,超臨界流體萃取的主要原理 物質(zhì)的溶解過程包括分子間的相互作用和擴散作用。物質(zhì)的溶解與溶劑的密度、擴散系數(shù)成正比，與粘度成反比，因此，超臨界流體對許多物質(zhì)有很強的溶解能力。且在溫度或壓力變化時，流體的密度、粘度和擴散系數(shù)隨著改變，與溶質(zhì)的親和力也跟著改變，從而使不同性質(zhì)的溶質(zhì)被分段萃取或分步析出，達到萃取、分離目的。,可以作為超臨界流體的物質(zhì)很多 如CO2、NH3、C2H6、CCl2F2、C7H16 等，實際應用CO2較多。 CO2的優(yōu)點： 1.臨界溫度（Tc=3

7、1.4）接近室溫，臨界壓力（Pc=7.37MPa）也不太高； 2.化學惰性； 3.無毒、無味、無嗅，不易燃易爆； 4.價格便宜 CO2在高于臨界溫度與臨界壓力的條件下，溶出中藥原料中的成分，當壓力與溫度恢復常壓或常溫時，溶解在CO2流體中的成分立刻與氣態(tài)CO2分開，達到萃取成分的目的。,CO2超臨界流體對物質(zhì)溶解作用有一定選擇性，主要和物質(zhì)的極性、沸點、分子量相關密切。 1.極性較低的化合物如酯、醚、內(nèi)酯和環(huán)氧化合物易萃取； 2.極性較大的化合物如羥基、羧基較多，萃取較難。 3.高分子化合物如蛋白質(zhì)、樹膠等，則很難萃取。,如何擴大超臨界流體萃取的適用范圍？ 加夾帶劑 夾帶劑是在被萃取物質(zhì)和超臨

8、界流體組成的二元系統(tǒng)中加入的第三組分，它可以改善原來物質(zhì)的溶解度,夾帶劑的研究與應用，很大程度上擴大了超臨界流體萃取法的萃取分離范圍。一般情況下，對溶質(zhì)具有很好溶解度的溶劑往往是很好的夾帶劑，常用甲醇、乙醇、丙酮等。夾帶劑的用量一般不超過15%。 其中，二氧化碳超臨界萃取法（SFE-CO2）已成功用于多種揮發(fā)油提取分離，如辣椒油和月見草油的萃取。通過加入夾帶劑成功地用于銀杏葉中總黃酮和總內(nèi)酯的萃取、穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯、丹參有效成分的萃取。,CO2-SFE的優(yōu)點： 低溫萃取，可防止熱不穩(wěn)定的成分被破壞或逸失； 幾乎不使用有機溶劑，無溶劑殘留，對環(huán)境無污染； 提取效率高，節(jié)約能耗。,四、其他方法

9、1. 升華法： 具升華性的化學成分，可用升華法直接從中藥原料中進行提取，如從茶葉中提取咖啡因，從樟木中提取樟腦等。 2. 組織破碎提取法： 某些對熱不穩(wěn)定成分可溶于水時，可用此法。 3. 壓榨法： 某些成分在新鮮原料中含量較高或新鮮原料富含肉質(zhì)可用壓榨法,4.超聲波提取,利用超聲波的空化作用和附加作用（如機械振動、乳化、擴散粉碎），使細胞壁破裂，加速植物有效成分溶出。 與常規(guī)方法比較：提取時間短、溫度低、收率高。 目前廣泛應用于中藥質(zhì)量分析和少量提取中。,5.微波輔助萃取技術,微波+有機溶劑代替單一的萃取 藥材組織受高頻電磁波輻射，分子運動加劇，細胞內(nèi)溫度迅速上升，細胞內(nèi)壓超過細胞壁的承受力，

10、細胞破裂，有效成分自由流出。另外，微波產(chǎn)生的電磁場，可加速被萃取物向萃取劑界面擴散，從而使萃取速度提高數(shù)倍，同時還降低了萃取溫度。 優(yōu)點：萃取時間短、溶劑用量少、設備簡單、成本低、提取效率高、產(chǎn)品質(zhì)量好。 目前微波萃取已用于多項中藥浸取生產(chǎn)線中，如葛根、茶葉、銀杏等。,6.酶解提取法,酶解提取法是在傳統(tǒng)提取方法的基礎上，根據(jù)植物細胞壁的構成，利用酶的極高催化活性和專一性等特點，選擇相應的酶，將細胞壁破壞，從而使植物細胞內(nèi)有效成分更易溶解、擴散出來。 常用于植物細胞破壁的酶：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、復合酶等。 優(yōu)點：條件溫和、節(jié)約能耗、效率高。,第二節(jié)、天然藥物有效成分的分離方法 利用共存

11、成分結構性質(zhì)差異（不同點） 一、兩相萃取法（溶劑分配法） 1.簡單萃取 是利用混合物中各成分在兩相溶劑中分配系數(shù)不同而達到分離的方法。兩相萃取法的兩相往往是互相飽和的水相和有機相?；旌衔镏懈鞒煞衷趦上嘀蟹峙湎禂?shù)相差越大，則分離效率越高。,分配系數(shù)：指在一定條件下某成分在兩相溶劑中溶解分配達到平衡時，該成分在兩種溶劑中濃度的比值。 (1)、分配系數(shù)：K=C上/C下 (2)、分離因子：= KA/KB（ KA KB）， 表示分離難易,一般 100，簡單萃取(2-3次) 50，10次以上 =1，無法分離,一般地： 極性較大的成分：選用正丁醇水（如分離皂苷類）； 極性中等的成分：選用乙酸乙酯水 （如分離

12、黃酮類）； 極性小的成分：選用氯仿（或乙醚）水（如分離苷元及游離生物堿）,2. 酸堿溶劑萃取 P19 利用混合物中各組分酸堿性的不同而進行分離。 pH與存在狀態(tài)： 對于酸、堿及兩性化合物，pH改變可使存在狀態(tài)改變, 即控制溶液的pH值，可控制存在狀態(tài)。 pKa=-log(A-H+/AH)=-logH+-log(A-/AH) =pH-log (A-/AH) log(A-/AH)=pH-pKa 2 即認為完全解離。,對于難溶于水的有機堿性成分，可與無機酸成鹽溶于水，借此可與非堿性難溶于水的成分分離； 對于具有羧基或酚羥基的酸性成分，可與堿成鹽而溶于水； 對于具有內(nèi)酯或內(nèi)酰胺結構的成分可被皂化（形成

13、鹽）溶于水，借此與其他難溶于水的成分分離。,3.PH梯度萃取法：P19 根據(jù)在一定PH下某成分可成鹽或可游離，改變該成分在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)而與其他成分分離。 以PH成梯度的酸水液,依次萃取用親脂性溶劑溶解的堿性成梯度的混合堿性成分；或以PH成梯度的堿水液,依次萃取用親脂性溶劑溶解的酸性成梯度的混合酸性成分。,二、系統(tǒng)溶劑分離法 P20 1.混合物溶于水，利用各組分極性差別，依次用極性由小到大的有機溶劑進行萃取，將混合物中各化學成分按極性由小到大的順序萃取出來。 2.柱色譜法，將混合物與吸附劑拌樣裝柱，依次用極性由小到大的有機溶劑分別洗脫。 該法常用于中藥化學成分的初步分離。,三、沉淀法 提

14、取濃縮液中加入某種試劑或溶劑使有效成分生成沉淀，或雜質(zhì)沉淀 如果將需要分離獲得的成分生成沉淀，這種沉淀反應必須是可逆的；如果是不需要的成分，則將生成的沉淀除去，此時所用的沉淀反應可以是不可逆的。,1.溶劑沉淀法 水提醇沉法 中藥水提液中加入乙醇至6080，放置，蛋白質(zhì)、多糖、果膠、粘液質(zhì)可沉淀。 2.酸堿沉淀法 堿性成分，可與無機酸成鹽溶于水，加堿又游離沉淀;酸性成分在堿中成鹽溶解，在酸中游離沉淀。,3.專屬試劑沉淀法 某些試劑能選擇性地沉淀某些（類）成分，稱為專屬試劑沉淀法。如雷氏銨鹽能與生物堿類生成沉淀；膽甾醇能與甾體皂苷沉淀；明膠能沉淀鞣質(zhì)，可用于分離或除去鞣質(zhì)。 4. 鹽析法 在混合物

15、水溶液中加入易溶于水的無機鹽，至一定濃度或飽和狀態(tài)，使某些中藥成分在水中溶解度降低而析出，或用有機溶劑萃取出來。最常用的無機鹽為NaCL。,四、結晶、重結晶法 利用混合物中各成分在溶劑中的溶解度不同達到的分離方法。 結晶法是純化物質(zhì)最后階段常采用的方法，其目的是進一步分離純化。 中藥中的一些親水性成分，如多糖、皂苷等雖往往無固定的晶形，常為無定形粉末，但也需通過結晶進行純化，以利于結構測定。 問題： 重結晶的操作？,結晶和重結晶操作： 提取或分離物 溶于選擇的溶劑，加熱成飽和溶 液，趁熱過濾 濾液 放置（冷藏）析晶，過濾 粗結晶 重復上述操作（重結晶） 結晶,影響結晶的因素 ： 1.結晶用溶劑

16、的選擇是最重要因素之一。 一般應符合下列條件： （1）對被結晶成分熱時溶解度大、冷時溶解度?。粚﹄s質(zhì)或冷熱時都溶解，或冷熱時都不溶解。 （2）與被結晶成分不發(fā)生化學反應。 （3）沸點適中。,2.純度：較純 3.被結晶成分的類型：分子小易結晶；分子大、含糖多，不易結晶。 4.溶液濃度：溶液濃結晶快，但結晶細碎，雜質(zhì)多；反之結晶慢，但晶形大、純度高。 5.結晶溫度和時間：溫度低、時間長，結晶好。,常用于結晶的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸、吡啶等。 當用單一溶劑不能達到結晶效果時，可用兩種或兩種以上溶劑組成混合溶劑進行結晶操作。,五、分餾法 P30 此法是利用混合物中各成分沸點的不同而進行

17、的分離方法。適用于液體混合物的分離。 分餾法分為常壓分餾、減壓分餾、分子蒸餾等?？筛鶕?jù)混合物中各成分沸點情況及對熱穩(wěn)定性因素選用。,六、膜分離法 利用天然或人工合成的高分子膜，以外加壓力或化學位差為推動力，對混合物溶液中分子大小不同的化學成分進行分離、分級、提純和富集。 微濾、超濾、納濾、反滲透為四大已開發(fā)應用的膜分離技術。溶劑、小分子能透過膜，而大分子被膜所截留。,膜分離的基本原理,膜分離的特點,常溫操作 操作簡單、連續(xù)化 無相變、能耗低 特別適用于對熱、對化學試劑敏感的物質(zhì),六、 色譜分離法 色譜分離法是天然藥物化學成分分離中最常使用的方法。其最大的優(yōu)點是分離效能高、快速簡便。 分類： 按

18、移動相的狀態(tài)分：氣相色譜（GC） 液相色譜（LC) 按操作方式分：柱色譜（CC) 薄層色譜（TLC) 紙色譜（PC) 按分離原理分：吸附色譜 分配色譜 離子交換色譜 凝膠色譜 大孔樹脂色譜,（一）.柱色譜法 1.吸附色譜 吸附色譜是利用混合物中各成分對吸附劑的吸附能力的差異，而實現(xiàn)分離的一類色譜。,物理吸附：無選擇性，吸附與解吸可逆， 如硅膠、氧化鋁、活性炭 吸附 化學吸附： 有選擇性，吸附牢固 半化學吸附：介于上述二者之間， 如聚酰胺 物理吸附：相似者易于吸附,常用的吸附劑包括硅膠、氧化鋁、活性炭、聚酰胺等。 硅膠 應用較廣泛，中藥各類化學成分大多均可用其進行分離。 氧化鋁 堿性或中性親脂性

19、成分的分離，如生物堿、甾、萜類等成分。不適于含酚羥基的化合物。 聚酰胺 以氫鍵吸附作用為主，主要用于分離酚類、醌類，如黃酮類、蒽醌類及鞣質(zhì)類等成分。,硅膠： 硅膠一般呈微酸性，其吸附活性中心為硅醇基，是一種極性吸附劑 柱層：100-160目 薄層：10-40，加壓可用于柱層 硅膠根據(jù)是否加入粘合劑可分為硅膠G（以煅石膏為粘合劑的硅膠）和硅膠H（不含任何粘合劑的硅膠）； 根據(jù)加入的無機熒光劑的不同又分為硅膠GF254硅膠GF365等。,鍵合硅膠 非極性鍵合硅膠 分類 極性鍵合硅膠 離子型鍵合硅膠 a. 非極性鍵合硅膠（反相硅膠）：硅膠表面鍵合極性很小的烷基。 如： 十八烷基、辛烷基、苯基烷等 極

20、性大的成分：吸附能力弱，先下 極性小的成分：吸附能力強，后下 b. 極性鍵合硅膠：鍵合CN、NH3、雙OH等 一般作正相層析 c、離子型鍵合硅膠：鍵合各種離子交換基團,氧化鋁極性吸附劑 （ 1）組成 堿性氧化鋁（pH 9） 中性氧化鋁（pH 7.5） 酸性氧化鋁（pH 23） 100160目柱層 200目 硬板TLC （2）活度： 含水量越少，吸附力越強，活度越小 含水量（%） 0 3 6 10 15 活度（級） I II III IV V （3）、應用 堿性氧化鋁分離生物堿和甾族化合物，不適于醛、酮、酯、有機酸 中性氧化鋁分離中性、堿性親脂性化合物，不適于酸性成分 酸性氧化鋁分離有機酸類，不

21、適于堿性成分 缺點：吸附力強，成分損失大,被分離成分極性 吸附力三要素 移動相極性 吸附劑活性 硅膠、氧化鋁為極性吸附劑，被分離成分極性大，吸附力強； 溶劑極性大，洗脫力強。 活性炭為非極性吸附劑，與此相反。 極性強弱比較 a .官能團極性：RCOOHAr-OHH2OR-OHR-NH2 RCONH2RCHORCOORR-ORR-XR-H b .官能團相同，極性官能團數(shù)目多，極性大。 C.介電常數(shù)越大，極性越強。,吸附劑和移動相的選擇： 依據(jù)被測組分、吸附劑和移動相的性質(zhì),1. 被測組分性質(zhì)（極性大?。?烴 - - - - - - - - 醇、羧酸 2. 吸附劑的活性： 吸附劑的活性大，對被測

22、組分的吸附能力強 強極性物質(zhì)選擇弱吸附劑 弱極性物質(zhì)選擇強吸附劑 3. 移動相的極性： 移動相極性大，對被測組分的洗脫能力大 “相似相溶”原則 ：根據(jù)組分性質(zhì)、吸附劑的活性， 選擇適當極性的流動相,三者關系圖示： 組分 吸附劑 移動相 極性 活性小 極性 非(弱)極性 活性大 非（或）弱極性,比移值Rf,當色譜條件一定時，Rf只與組分性質(zhì)有關。 組分極性大， Rf值小。,薄層色譜 p27,聚酰胺 P171 種類： 錦綸6聚己內(nèi)酰胺 錦綸66己二酸和己二胺聚合而成 適用范圍：黃酮、酚類、醌類、有機酸等 不可用于鞣質(zhì)，吸附力特強，成為不可逆吸附，但可吸附除去,半化學吸附：聚酰胺（氫鍵締合）,影響因

23、素： a、樣品的影響,b、溶劑的影響 聚酰胺在水中成氫鍵的能力最強 洗脫能力： 水甲醇丙酮氫氧化鈉水溶液甲酰胺二甲基酰胺尿素水溶液,2.分配色譜 利用被分離成分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而達到分離。 按固定相與流動相的相對極性分： 在正相分配色譜法中，流動相的極性小于固定相的極性。常用的固定相有氰基與氨基鍵合相。極性小的跑得快。 在反相分配色譜法中，流動相的極性大于固定相的極性。常用的固定相有十八烷基硅烷（ODS）或C8鍵合相。流動相常用甲醇水或乙腈水系統(tǒng)。極性大的跑得快。,反相色譜法,正相色譜法,紙色譜法,將固定相承載在紙上，以紙做載體進行點樣、展開、定性、和定量的液-液分配色譜法,

24、固定相：紙纖維吸著的水 流動相：與水不互溶的有機溶劑（如：飽和正丁醇）,討論：Rf與組分性質(zhì)、流動相極性及溶解度有關 正相：極性組分易保留，Rf ?。鲃酉鄻O性， Rf ） 非極性組分易流出，Rf大（流動相極性，Rf ）,3.離子交換色譜 適用于可解離成分的分離 利用混合物中各成分解離度差異進行分離 離子交換劑有：離子交換樹脂 離子交換纖維素 離子交換凝膠 陽離子交換樹脂 強酸型（SO3H） 弱酸型（COOH） 陰離子交換樹脂 強堿型 N（CH3）3X N（CH3）2（C2H4OH）X 弱堿型 NR2 NHR,離子交換樹脂對化合物的交換能力強弱，主要取決于化合物解離度的大小，帶電荷的多少等因素

25、。 化合物解離度大（酸性、堿性強）易交換在樹脂上，相對來說難以洗脫。當二種不同解離度的化合物被交換在樹脂上，解離度小的化合物比解離度大的化合物先洗脫下來，由此達到分離的目的。 離子交換纖維素、凝膠 陽離子交換纖維素：酸性基團接在纖維素或葡聚糖凝膠上。 陰離子交換纖維素：堿性基團接在纖維素或葡聚糖凝膠上。,4.大孔樹脂色譜 大孔樹脂是一類沒有可解離基團，具有多孔結構，不溶于水的固體高分子物質(zhì)。是繼離子交換樹脂之后發(fā)展起來的一類新型材料。 原理：吸附性（范德華力及氫鍵）、篩選性（多孔網(wǎng)狀結構）結合。 依據(jù)分子體積大小及吸附力不同而分離 水液中吸附力強。,性狀： 白色球形顆粒，粒度2060目，不溶于

26、酸、堿、有機溶劑 類型： 非極性苯乙烯型 極性2-甲基丙烯酸酯型,影響因素： 樹脂型號、溶劑種類及化合物性質(zhì)等 a.分子極性 極性大的成分中極性樹脂分離； 極性小的成分非極性樹脂分離。 b.分子大小：分子大，吸附力強，選擇大孔徑樹脂。 c.pH值影響： 酸性成分： 酸性條件下易被吸附 堿性成分： 堿性條件下易被吸附 中性成分： 中性條件下易被吸附,洗脫液的選擇： 可選用不同濃度的MeOH、EtOH、Me2CO； 流速0.55ml/min。 非極性大孔樹脂 洗脫劑極性越小，洗脫能力越強。 極性大孔樹脂 洗脫劑極性越大，洗脫能力越強。,實際工作中，常先將欲分離混合物的水溶液通過大孔吸附樹脂后，依次

27、用水，濃度由低至高的含水甲（乙）醇溶液洗脫，可將混合物分離成若干組分。近年來，大孔吸附樹脂色譜被應用于中藥有效成分或有效部位如皂苷、生物堿黃酮等的分離富集。,其優(yōu)點是：選擇性好，機械強度高，再 生處理方便，吸附速度快等特點。 缺點：樹脂殘留物（甲苯、二甲苯等）,5.凝膠過濾色譜（排阻色譜，分子篩色譜） 根據(jù)凝膠的孔徑和被分離化合物分子的大小而達到分離目的。 當混合物溶液通過凝膠柱時，比凝膠孔隙小的分子可以自由進入凝膠內(nèi)部，而比凝膠孔隙大的分子不能進入凝膠內(nèi)部，只能通過凝膠顆粒間隙，因此移動速率有差異。 分子大的物質(zhì)不被排阻，保留時間較短，先流出柱體，分子小的物質(zhì)進入孔隙內(nèi)被滯留，保留時間較長，

28、后流出柱體，由此而達到分離。,根據(jù)分子量大小差別： 按分子由大到小順序出柱。,商品凝膠的種類很多，常用的是葡聚糖凝膠(Sephadex G )、羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20 )。 Sephadex G是由葡聚糖和甘油通過醚橋相互交聯(lián)而成。親水性，只適于水中應用。不同規(guī)格適合分離不同分子量的物質(zhì)。 Sephadex LH-20為羥丙基葡聚糖凝膠，既有親水性又有親脂性，因此不僅可在水中應用，也可在極性有機溶劑中應用。在由極性及非極性溶劑組成的混合溶劑中常起到反相色譜的作用。,（二）、加壓液相色譜 根據(jù)所用壓力大小不同，可分為 高效液相色譜（HPLC，20個大氣壓）， 中壓液相色譜

29、（MPLC 520個大氣壓）， 低壓液相色譜（LPLC,5個大氣壓）， 快速色譜（flash chromatography,約2個大氣壓）等。 分配色譜已成為中藥化學成分分離的常規(guī)技術手段。,高效液相色譜（HPLC）,高效液相色譜法（high performance liquid chromatographyHPLC),是以經(jīng)典柱色譜法為基礎，引入了氣相色譜法的理論和實驗方法，流動相改為高壓輸送，采用高效固定相及在線檢測手段發(fā)展而成的一種高效、快速、高靈敏的分離分析技術。 按分離原理有：液固吸附、液液分配、離子交換、離子對、離子色譜、空間排阻、親和色譜等。 氣相色譜（GC)、高速逆流色譜、親和

30、色譜,第三節(jié)、天然藥物化學成結構研究方法,經(jīng)過提取、分離、精制得到的有效成分，必須鑒定或測定其化學結構，才可能為深入探討有效成分的生物活性、構效關系、體內(nèi)代謝以及進行結構改造、人工合成等研究提供必要的依據(jù)。有效成分的鑒定和結構測定，是本學科的重要內(nèi)容之一。 在進行有效成分的結構研究之前，必須對該成分進行純度檢驗，以確定其為單體化學成分。,一、純度鑒定 1）物理常數(shù)：mp、 D 2）TLC（PC）：三種展開系統(tǒng)均為單一斑點。 3）GC，HPLC,一般樣品用兩種以上溶劑系統(tǒng)或色譜條件進行檢驗，均顯示單一的斑點或譜峰；結晶樣品的熔距為0.51.0;液體樣品的沸程在5以內(nèi)，即可認為是比較純的單體化學成

31、分，可用于化合物的鑒定和結構測定。 在進行有效成分的結構鑒定時，應進行文獻調(diào)研，結合定性分析，判斷該化合物的基本骨架、結構類型。,如可能為已知化合物，在有對照品的情況下，最好用對照品進行熔點、混合熔點、色譜和紅外光譜對照。 如果樣品與對照品熔點相同，混合熔點不下降，色譜中的Rf值相同，IR光譜相同，則可判定樣品與對照品為同一化合物。,若無對照品，則多做些數(shù)據(jù)，或制備衍生物與文獻數(shù)據(jù)核對。如果所要鑒定的化合物為文獻未記載的物質(zhì)時，則要進行結構測定。 近代各種波譜法，在鑒定或確定化學結構中，發(fā)揮著極為重要的作用。而經(jīng)典的化學方法，退居次要的地位。但也并不意味著可以完全不需要經(jīng)典的化學方法。應該是二

32、種方法相互補充，相互印證。,二、結構研究一般程序,物理常數(shù)測定,推測母體結構類型 功能基情況,分子量分子式的確定,波譜、化學方法 推測出結構式,人工合成進行確認,1物理常數(shù)的測定 物理常數(shù)的測定包括： 熔點 沸點 比旋度 折光率 密度等。,2分子式的測定 目前最常用的是質(zhì)譜法（MS）。高分辨質(zhì)譜法（HR-MS）不僅可給出化合物的精確分子量，還可以直接給出化合物的分子式。 如青蒿素的HR-MS中，分子離子峰為m/z282.1472,可計算出其分子式為C15H22O5（計算值282.1467）。也可通過質(zhì)譜中出現(xiàn)的同位素峰的強度推定化合物的分子式。 有時化合物的分子離子峰不穩(wěn)定，難以用HR-MS測

33、出,需進行元素分析，確定元素種類，各元素在化合物中所占的百分含量，從而求出化合物的實驗式，再用FD-MS，F(xiàn)AB-MS測其分子量，以求得化合物的分子式。,3化合物結構骨架與官能團的確定 一般首先確定化合物的不飽和度 =1/2（2n4+n3-n1+2） 問題: C8H8O的不飽和度? 通過各類化學成分的顯色反應，色譜行為、酸堿性、溶解性等，結合文獻調(diào)研及波譜等推定分子骨架和官能團。,4、化合物結構的確定： 1）、光譜方法：測定并分析UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS譜學數(shù)據(jù) 2）、化學溝通：化學降解、衍生物制備等 3）、立體結構：CD（圓二色譜）、ORD（旋光譜）、2D-NMR、X-

34、射線衍射、人工合成,三、結構測定中常用的波譜分析方法 目前，波譜分析已成為確定化學結構的主要手段。尤其是超導核磁共振技術的普及和各種二維核磁共振譜（2D-NMR）及質(zhì)譜新技術的開發(fā)利用，具備了靈敏度高、選擇性強，用量少、快速、簡便等優(yōu)點，大大地加快了確定化合物結構的速度和準確性。,（一）.紫外光譜(UV),UV光譜在化學成分研究中的主要用途 a. 與對照品或標準圖譜對照，可用于化合物的初步鑒定； b. 根據(jù)BeerLamber定律可用于有效成分的含量測定； c. 可提供分子中共軛體系的結構信息，據(jù)此判斷共軛體系中取代基的位置、種類和數(shù)目。,單獨靠UV光譜不能決定分子結構，但對某些具有共軛體系的

35、化學成分，如蒽醌類、黃酮類以及強心苷類等成分的結構特征的確定有著重要的使用價值。,（二）.IR光譜 用IR測定結構時，如果被測定的是已知物，只要和已知對照品做一張共IR圖譜，如二者IR譜圖完全一致，則基本可推測是同一物質(zhì)。如無對照品，也可檢索有關IR譜圖文獻。 IR對未知化合物的鑒定，主要用于功能基的確認,芳環(huán)取代類型的判斷等。,（三）.MS譜 化合物分子用一定方式裂解后，生成各種離子，按其質(zhì)量大小排列而成的圖譜。 重要參數(shù)： 分子離子（峰）分子失去一個電子后形成的正離子。其質(zhì)荷比在數(shù)值上就是該分子的分子量。 近年來，隨著現(xiàn)代分析技術的飛速發(fā)展，新的離子源不斷出現(xiàn)，使質(zhì)譜在確定化合物分子量、元

36、素組成及根據(jù)裂解碎片檢測官能團、辨認化合物類型、推導碳骨架等方面發(fā)揮著重要作用。,主要離子源的電離方式及特點 1、電子轟擊質(zhì)譜（EIMS） 在電子轟擊條件下，大多數(shù)分子電離后生成缺一個電子的分子離子，并繼續(xù)發(fā)生鍵的斷裂形成“碎片”離子。這對推化合物的結構十分有用。 但當樣品相對分子量較大或?qū)岱€(wěn)定性差時，常常得不到分子離子，因而不能測定這些樣品的分子量。EIMS仍是用得最普遍的技術。,2、化學電離質(zhì)譜（CIMS） 通過引入大量的試劑氣體產(chǎn)生的反應離子與樣品分子之間的離子分子反應，使樣品分子實現(xiàn)電離。利用化學電離源，即使是不穩(wěn)定的化合物，也能得到較強的準分子離子峰，即M1峰，從而有利確定其分子量

37、。但此法的缺點是碎片離子峰較少，可提供的有關結構方面的信息少。,3、場解析質(zhì)譜（FD-MS） FD-MS特別適用于難汽化和熱穩(wěn)定性差的固體樣品分析。如有機酸、甾體類、糖苷類、生物堿、氨基酸、肽和核苷酸等。 此法的特點是形成的M+沒有過多的剩余內(nèi)能，減少了分子離子進一步裂解的概率，增加了分子離子峰的豐度，碎片離子峰相對減少。因此用于極性物質(zhì)的測定，可得到明顯的分子離子峰或M+1+峰，但碎片離子峰較少，對提供結構信息受到一些局限。,4、快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS） 這種技術采用液體基質(zhì)（如甘油）負載樣品，然后以高能量的惰性原子束轟擊表面試樣，再對由此產(chǎn)生的二次離子進行質(zhì)譜分析。 此方法常用于大分

38、子極性化合物特別是用于糖苷類化合物的研究。除得到分子離子峰外，還可得到糖和苷元的結構碎片峰，從而彌補了FD-MS的不足。,5、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI- MS） 此種質(zhì)譜技術適用于結構較為復雜、不易氣化的大分子如多肽、蛋白質(zhì)等的研究，可得到分子離子、準分子離子和具有結構信息的碎片離子。,6、電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS） 是一種使用強靜電場的電離技術，既可分析大分子，也可分析小分子。對于分子量在1000Da（道爾頓）以下的小分子，會產(chǎn)生M+H+或M-H+離子，選擇相應的正離子或負離子形式進行檢測，就可得到物質(zhì)的分子量。而分子量高達20000Da的大分子會生成一系列多電荷離子，通過數(shù)

39、據(jù)處理系統(tǒng)能得到樣品的分子量。,7、串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS） 串聯(lián)質(zhì)譜可表示為MSMS，隨著串聯(lián)級數(shù)的增加進而表示為MSn，其中n表示串聯(lián)級數(shù)。 這是一種用質(zhì)譜作質(zhì)量分離的質(zhì)譜技術。它可以研究母離子和子離子的關系，獲得裂解過程的信息，用以確定前體離子和產(chǎn)物離子的結構。 近年，國內(nèi)亦有將此技術用于鑒定中藥有效部位中的各種成分的化學結構的研究報道。,（四）.核磁共振譜（NMR）,NMR譜能提供分子中有關氫及碳原子的類型、數(shù)目、互相連接方式、周圍化學環(huán)境以及構型、構象的結構信息。所以NMR譜在化合物結構測定中顯得非常重要。,（1）1H-NMR： 提供信息： 化學位移； 積分曲線（氫數(shù)）； 偶合常數(shù) J

40、 化學位移: 共振峰所在的位置（相對） ：范圍020ppm 偶合常數(shù) J: 相鄰磁核之間自旋偶合或自旋干擾，導致吸收峰發(fā)生裂分，兩個小峰之間的距離。(HZ）,如：,除了正常的1H-NMR譜技術外，還有一些幫助結構分析的輔助技術，如選擇性去偶、重氫交換，加入反應試劑、各種雙照射等。,應用較多的雙照射技術是NOE，也稱核的增益效應。,（2）13C-NMR譜 13C-NMR提供的結構信息是分子中各種不同類型及化學環(huán)境的碳核的化學位移，異核偶合常數(shù)（JC-H）及弛豫時間（T1）。 其中利用度最高的是化學位移（c） 范圍0250ppm 不同類型碳化學位移大致范圍： P37表2-3,常見的13C-NMR測

41、定技術如下： A、全氫去偶譜： 也稱質(zhì)子噪音去偶或質(zhì)子寬帶去偶。此時H的偶合影響全部消除，從而簡化了圖譜。在分子中沒有對稱因素和不含F(xiàn)、P等元素時，每個碳原子都會給出一個單峰。雖無法區(qū)別碳上的數(shù)目，但對判斷C信號的化學位移十分方便。,噪音去偶譜：又叫全氫去偶譜（COM）或?qū)拵ヅ甲V（BBD）： 所有碳信號作為單峰出現(xiàn),B、偏共振去偶（OFR） 在偏共振去偶譜中，每個連接H的C原子有殘余裂分，故在所得圖譜中CH呈二重峰（d），CH2呈三重峰（t），CH3呈四重峰（q），季碳為單峰（s），且強度最低，由此可獲得碳所連接的質(zhì)子數(shù)、偶合情況等信息。但此法各信號的裂分峰相互重疊，難以全部識別和解析。,C

42、、DEPT（無畸變極化轉移增強法） 在DEPT法中，通過改變照射1H的脈沖寬度（）使成為45、90和135變化并測定13C-NMR譜。所得結果與INEPT譜類似。不同類型13C信號在譜圖上呈單峰形式分別朝上或朝下伸出，易識別。 當= 45時，所有的CH、CH2、CH3為正信號；當=90時，僅顯示CH的正信號；當=135時,CH、CH3為正信號, CH2負信號。季碳同樣無信號出現(xiàn)。,如：,D、NOE譜,NOE是在核磁共振中選擇性地照射一種質(zhì)子使之飽和，則與該質(zhì)子在立體空間位置上接近的另一個或數(shù)個質(zhì)子的信號強度增高的現(xiàn)象（增益）。它不但可以找出互相偶合的兩個核的關系，還可以反映出不互相偶合但空間距離較近的兩個核間關系 。,如五味子酯甲中聯(lián)苯雙酯部分有二個芳H，1H-NMR示有二個峰，值分別為6.76，6.43，這二個單峰的歸屬可用NOE技術予以確定。,照射3.64的甲基， 發(fā)現(xiàn)位于6.76的芳H峰增益19% 而照射其他三個甲基， 均未見到NOE現(xiàn)象，故推測位于甲氧基鄰位芳H值為6.76， 而位于亞甲二氧基鄰位芳H值為6.43。,(3)、二維核磁共振譜（2DNMR） 二維化學位移相關譜（COSY）是2DNMR譜中最主要，也是最常用的一種測試技術。 2DNMR譜又分為同核和異核相關譜兩種。 常用： HMQC