1、臨床基因擴增檢驗實驗室的設(shè)置、質(zhì)量管理體系的建立及其技術(shù)驗收,云南省臨床檢驗中心 2007，12，20,題外話：,不參加實習課？ 參加實習課？,對相關(guān)管理文件的理解：,臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法 臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準（第六條） 臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范（第十條、第十三條、第十四條） 臨床實驗室必須遵循的管理辦法及其它行業(yè)標準,強調(diào)：,污染的控制：預(yù)防為主 質(zhì)量保證,污染的途徑：,實驗材料 試劑每一成分 設(shè)備的每一部位 每一操作步驟,污染的判斷：,經(jīng)驗： 全陽性，ct值35；標準品的ct值發(fā)生波動 陰性質(zhì)控陽性 陽性率異常增高 輕微污染和非特異性擴增？,污染和非特異性

2、擴增:,目的基因 過程控制,反應(yīng)體系（引物、模版、酶、鎂離子、退火、循環(huán)） 條件優(yōu)化,控制的手段：,工作區(qū)的嚴格劃分 sop的制訂和嚴格執(zhí)行 去污染措施的常規(guī)采用,污染的監(jiān)測：,陰性質(zhì)控的設(shè)置： 陰性血清樣本 以水為模擬標本 僅含擴增反應(yīng)液 （加鑒別實驗室是否污染的空白管),質(zhì)控品的位置,標準品空白陽性質(zhì)控陰性質(zhì)控臨床樣本,標準品空白陽性質(zhì)控臨床樣本陰性質(zhì)控,實驗室的設(shè)置,管理要求：設(shè)置標準和工作規(guī)范 具體落實：實事求是、因地制宜,設(shè)置標準和工作規(guī)范,“原則上分為四個分隔的工作區(qū)； 各區(qū)必須有明確的標記” “每一區(qū)域都須有專用的儀器；不同的工作區(qū)應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服；離開工作

3、區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出” “，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價” “，本區(qū)如采用副壓條件或減壓情況下可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前區(qū)的可能性。,理想的設(shè)置,磁性連鎖裝置,現(xiàn)實的問題是：,建筑結(jié)構(gòu) 通道、門 水電供應(yīng) 采光、通風,基本的要求:,四個區(qū)域必須是相互獨立的 各區(qū)的儀器設(shè)備及各種物品必須是專用的 各區(qū)間不能直通，應(yīng)有緩沖間，供換工作服及鞋子用 產(chǎn)物分析區(qū)應(yīng)安裝排風扇或其它抽風裝置。,實例：,實例：,實例：,實例：,樣本處理區(qū),實例：,小結(jié)：,處理原則的核心是通過合理的設(shè)置解決好臨床pcr檢測實際運作動態(tài)過程中可能發(fā)生的污染的預(yù)防問題 因此，實驗室的設(shè)計必須充分考慮到對污

4、染來源和污染途徑的預(yù)防和控制,實驗室各區(qū)的功能和配置：,試劑儲存和準備區(qū),儲存試劑的制備 試劑的分裝 主反應(yīng)混合液的制備,冰箱 混勻器 微量加樣器 可移動紫外燈 專用工作服和工作鞋 消耗品（帶濾心吸頭、離心管、一次性手套等） 專用辦公用品等。,標本制備區(qū)：,臨床標本的保存 核酸提取、儲存及其加入至擴增反應(yīng)管 測定rna時cdna的合成 不得在本區(qū)對樣本進行pcr擴增,冰箱 (28和-20或-80) 高速臺式冷凍離心機 水浴箱和/或加熱模塊 生物安全柜 混勻器 微量加樣器 可移動紫外燈 專用工作服和工作鞋 專用消耗品 專用辦公用品等,擴增區(qū)：,dna 或cdna擴增 已制備的dna模板和合成的c

5、dna的加入 主反應(yīng)混合液制備成反應(yīng)混合液 如果空間允許的話，模板的加入也可以在一個獨立的空間內(nèi)完成,核酸擴增儀 微量加樣器(視情況定) 可移動紫外燈 專用工作服和工作鞋 專用消耗品 專用辦公用品等,產(chǎn)物分析區(qū)：,擴增片段的測定 最主要的擴增產(chǎn)物污染來源 有可能使用致突變和有毒物質(zhì),微量加樣器 可移動紫外燈 專用工作服和工作鞋 專用消耗品 專用辦公用品等,輔助用房：,清潔區(qū) 標本接受區(qū)：靈活設(shè)置 不干擾四區(qū) 規(guī)范的保存和傳遞,實驗室使用和管理：,標本接受區(qū),樣本制備區(qū),擴增區(qū),產(chǎn)物分析區(qū),區(qū)域的適當合并：,“由于測定技術(shù)總是在發(fā)展之中，區(qū)域的合并應(yīng)根據(jù)儀器的特點而定”,小結(jié)：,從核心儀器特點、

6、實驗室的現(xiàn)狀出發(fā)，綜合考慮管理要求 盡可能在現(xiàn)有條件下滿足管理要求 以管理措施彌補硬件的不足 有條件，留有余地 再好的分區(qū)設(shè)置，如果不輔之與認真執(zhí)行的相應(yīng)的管理制度，等同于無。,實驗室質(zhì)量體系的建立：,管理要求 體系建立,管理要求：,1 實驗室設(shè)置和設(shè)備 1.1 實驗室原則上應(yīng)分為四個區(qū)，但如使 用全自動擴增檢測儀，區(qū)域可適當合 并。 1.2 各工作區(qū)的明確標記 1.3 實驗室設(shè)置應(yīng)能有效地防止pcr后區(qū)產(chǎn) 物的污染。 ,管理要求：,2 設(shè)施和環(huán)境 2.1 實驗室的設(shè)施、工作區(qū)域、能源、照明、 溫控、通風等。應(yīng)便于檢測工作的正常進行。 2.2 實驗室應(yīng)配備溫度濕度計、穩(wěn)壓電源等。 2.3 進入

7、和使用實驗室各區(qū)域應(yīng)有明確的限制和 控制。 2.4 應(yīng)有實驗室清潔、消毒制度及相應(yīng)用具； 2.5 實驗室應(yīng)有有關(guān)生物污染物處理、生物防護 等措施及相應(yīng)用具；,管理要求：,3 人員 3.1 實驗室應(yīng)配備足夠數(shù)量的人員； 這些人 員必須經(jīng)過培訓，并取得上崗證； 3.2 實驗室應(yīng)有培訓計劃和措施，保證其技術(shù) 人員得到及時培訓。 3.3 實驗室應(yīng)保存其技術(shù)人員有關(guān)資格證書 （如上崗證）、培訓、技能和經(jīng)歷等技術(shù)檔案。,管理要求：,4 設(shè)備管理 4.1 主要設(shè)備應(yīng)有維護程序文件及維護記錄； 4.2 (a)有問題的設(shè)備應(yīng)立即停止使用，并加上明顯標識，如可 能應(yīng)將其貯存在規(guī)定的地方直至修復；(b)修復的設(shè)備必

8、須 經(jīng)校準、檢定（驗證）或檢測滿足要求后方能再次投入使 用；(c)實驗室應(yīng)檢查由于上述缺陷對以前所進行的檢測工 作的影響。 4.3 加樣器、溫度計、擴增儀和酶標儀等應(yīng)有校準程序并進行 校準，擴增儀和酶標儀應(yīng)有明顯的標識表明其校準狀態(tài)。 4.4 應(yīng)保存擴增儀、酶標儀、生物安全柜、加樣器等設(shè)備的檔 案,管理要求：,5 檢測方法 5.1 實驗室應(yīng)制定：有關(guān)儀器設(shè)備操作程 序；有關(guān)擴增檢測的工作程序。 5.2 所有上述標準操作程序都應(yīng)現(xiàn)行有效并便 于工作人員使用。 5.3 實驗室應(yīng)有儀器、試劑、消耗品的選購、 驗收、貯存和質(zhì)檢程序； 必須使用經(jīng)國 家有關(guān)部門批準的試劑和儀器。,管理要求：,6 標本管理

9、 6.1 實驗室應(yīng)建立對擬檢測標本的唯一編號識別系統(tǒng)。 6.2 實驗室應(yīng)制定有關(guān)標本收集、處理、運送、貯存 程序。 6.3 在接收標本時應(yīng)有其狀態(tài)的詳細記錄。 6.4 實驗室應(yīng)確定標本是否符合檢測要求, 拒收標本 原因要明確。 6.5 如果標本必須在特定的環(huán)境條件下（如2-8、 -20和-70低溫）貯存，則應(yīng)對這些條件加以 維持、監(jiān)控和記錄；,管理要求：,7 記錄 7.1 實驗室應(yīng)有適合自身實際情況又符合現(xiàn) 行規(guī)章制度的記錄管理制度； 7.2 記錄應(yīng)有參與標本收集、標本準備和處 理、檢測的人員簽字。 7.3 所有記錄和報告都應(yīng)安全貯存、妥善保 管并保密。,管理要求：,8 報告 8.1 檢測結(jié)果

10、的報告應(yīng)準確、清晰和客觀。定性測定報告“陰 性”或“陽性”；定量測定則以拷貝數(shù)/ml或iu/ml報告。 8.2 每份報告應(yīng)包括以下信息：（a）標題，例如“檢測報告” （b）報告的唯一性標識（如序號）；（c）檢測標本的特性 和狀態(tài)；（d）檢測標本的接收時間和進行檢測的時間； （f）采用的檢測方法；（g）實驗操作及校核人員的簽字， 以及簽發(fā)日期；（h）檢測報告中應(yīng)給出參考結(jié)果或范圍； 8.3 當報告的有效性發(fā)生疑問時，實驗室應(yīng)立即通知臨床相關(guān) 科室予以改正。 8.4 當臨床科室或患者要求用電話、圖文傳真或其它電子和電 磁設(shè)備傳送結(jié)果時，實驗室應(yīng)保證工作人員遵循文件化的 程序，并為對方保密。,管理要

11、求：,9 質(zhì)量控制 9.1 實驗室應(yīng)有室內(nèi)質(zhì)量控制標準操作程序 文件：（a）質(zhì)控物的合理性； （b）質(zhì)控方法（圖）的有效性； （c）失控的判斷； （d）失控的措施。 9.2 實驗室應(yīng)參加室間質(zhì)量評價,管理要求：,10 抱怨 10.1 實驗室應(yīng)制定抱怨及其處理的標準操作程序；應(yīng) 將抱怨資料及處理抱怨所采取的措施及結(jié)果記錄 歸檔保存。 10.2 當抱怨或其它任何事項是對實驗室是否符合其現(xiàn) 行程序、或者是否符合臨床基因擴增實驗室管 理暫行辦法和臨床基因擴增實驗室工作規(guī) 范、或是對其它有關(guān)實驗室校準或檢測質(zhì)量提 出疑問時，則實驗室應(yīng)立即對這些范圍的工作和 有關(guān)職責進行審核。,管理要求（現(xiàn)場考核）：,送

12、審的文件描述與實驗室實際情況的一致性 實際運行與文件規(guī)定的一致性 人員素質(zhì)：對文件的認知、熟悉、靈活運用程度,現(xiàn)場考核的實際內(nèi)涵：,認識到不到位 落實到不到位 符合性檢查加指導性檢查 有重點的全面檢查,建立質(zhì)量管理體系首先要解決的問題：,第一個問題：質(zhì)量體系建立的核心問題是什么？ 第二個問題：質(zhì)量體系模式要達到的管理目的是什么？ 第三個問題：達到目的的方法（途徑、手段）是什么？,質(zhì)量體系的定義,為實施質(zhì)量管理所需的組織結(jié)構(gòu)、程序、過程和資源。 要點：定義涵蓋了實驗室管理的每一個 方面。,組織結(jié)構(gòu)：一個組織為行使其職能，按某種方式建立的職責、權(quán)限及其相互關(guān)系。 程序：為進行某項活動所規(guī)定的途徑。

13、 過程：將輸入轉(zhuǎn)化為輸出的一組彼此相關(guān)的資源和活動。,四個組成部分的關(guān)系：,關(guān)鍵：核心過程（活動） 紐帶程序 組織結(jié)構(gòu) 程序 資源 過程,理解,“過程”的重要性 1、工作是通過過程來完成的。 2、質(zhì)量管理是通過對各種過程的控制 來實現(xiàn)的。 3、質(zhì)量管理本身也是一系列的過程 過程的分解、控制 過程的有機組合,過程,質(zhì)量體系運行的目的,主要手段：質(zhì)量體系文件,質(zhì)量方針： 質(zhì)量手冊：闡明實驗室的質(zhì)量方針，各方面質(zhì)量管理的一般性描述 程序性文件：對通用于整個實驗室的某些方面工作的文件化描述 標準操作程序（sop文件）：是實驗室最為具體、最具有可操作性、也是使用頻率最高的文件,pcr實驗室技術(shù)驗收對文件

14、的要求：,儀器設(shè)備的維護保養(yǎng)程序； 儀器設(shè)備的校準程序； 儀器設(shè)備的操作程序； 臨床標本的收集程序； 臨床標本的處理（核酸純化）程序； 臨床標本的保存程序； 核酸擴增及產(chǎn)物分析檢測的操作程序； 試劑的質(zhì)檢操作程序； 實驗室消耗品購買、驗收和貯存程序； 實驗室廢棄物的處理程序； 實驗室的清潔程序； 室內(nèi)質(zhì)量控制程序； 抱怨處理程序。,申請表的附錄5“需準備的標準操作程序（最低要求）” 對實驗室的質(zhì)量手冊和程序文件沒作要求 對必須具備的sop文件的編撰格式?jīng)]作具體要求,sop：實驗室最具個性的文件,不夠嚴謹準確 不夠連貫 不夠嚴密,例：,用加樣槍取100l樣品加入提取液 用加樣器（移液器）以前進式

15、移液法吸取100l樣品加入提取液,例：,向一新的經(jīng)高壓滅菌處理過的0.5ml離心管中加入10l充分混勻的rna提取液a（rna提取液a易沉淀，取樣前需用移液器反復吸打混勻后吸?。?。加人50l血清標本或陰陽性標準品，再加人200l的rna提取液b充分混勻。室溫放置5分鐘。6000rpm離心1分鐘，小心吸去上清，用75的預(yù)冷乙醇（depc水配制）洗沉淀兩次。（取75乙醇450l洗沉淀，充分震蕩混勻，6000rpm，離心1分鐘，然后去上清，再用75的乙醇450l洗一次），65干燥沉淀10分鐘。（注： 75%乙醇配制時須用試劑盒中提供的depc h2o）。,機械地抄書、說明書、其它實驗室的文件。,撰寫

16、sop文件要做到：,具有專業(yè)知識的人，按文件就能順利完成實驗 忠實而且連貫地反映實驗過程 對文件表述的理解無歧義 嚴謹、嚴密 準確和簡練,文件的文字組織：簡練明確,向一新的經(jīng)高壓滅菌處理過的0.5ml離心管中加入10l充分混勻的rna提取液a（rna提取液a易沉淀，取樣前需用移液器反復吸打混勻后吸?。?。加人50l血清標本或陰陽性標準品，再加人200l的rna提取液b充分混勻。室溫放置5分鐘。6000rpm離心1分鐘，小心吸去上清，用75的預(yù)冷乙醇（depc水配制）洗沉淀兩次。（取75乙醇450l洗沉淀，充分震蕩混勻，6000rpm，離心1分鐘，然后去上清，再用75的乙醇450l洗一次），65干

17、燥沉淀10分鐘。（注： 75%乙醇配制時須用試劑盒中提供的depc h2o）。,質(zhì)量體系文件的構(gòu)成：,程序文件和sop的關(guān)系,對通用于整個實驗室的某些方面工作的文件化描述,具體操作的標準化文件,程序文件等同于以往的管理制度 sop等同于以往的操作卡或操作說明書,what who where when why,how,寫合乎管理要求的 ，寫你做得到的,難點：,寫你所做的 做你所寫的 記錄你所做的,關(guān)鍵：sop和記錄的必要性和重要性,儀器設(shè)備的校準程序,目的：保證檢驗的有效性，準確性。 范圍：本程序適用于滿足pcr實驗室檢測需要并可能對檢驗結(jié)果造成誤差的儀器設(shè)備。主要有： 職責：校準由pcr實驗室

18、主任負責組織執(zhí)行。 工作流程： 4.1 校準方法： finpipette可調(diào)式移液器校準采用廠家推薦方法。校準主要使用設(shè)備為bs110s電子天平（max 110g, d=0.1mg）。 4.2 校準計劃： 4.2.1 啟用校準：設(shè)備在投入使用時實施啟用校準。 4.2.2 周期校準：設(shè)備在投入使用后，每半年實施一次校準。 4.2.3 維修后校準：設(shè)備在維修后須經(jīng)校準方可重新投入使用。 4.2.4 校準計劃外的校準：如在檢測及eqa，iqc活動中發(fā)現(xiàn)存在結(jié)果漂移或偏差及其它可疑情況時，通 過分析對可疑設(shè)備實施校準。 4.2.5 finpipette可調(diào)式移液器的校準順序：按照單一流向規(guī)定，對finpipette可調(diào)式移液器的校準首先 校準試劑準備區(qū)，然后依次為樣本處理區(qū)和pcr擴增區(qū)。每校準完一個區(qū)的移 液器，將其放回原處后，再取下一個區(qū)的移液器進行校準。 4.2.6 校準安排在不進行樣本檢測的日期完成。 4.3 校準的有效標識：經(jīng)校準的設(shè)備加貼綠色標簽，標簽上應(yīng)標明本次校準的日期和結(jié)果及下次校準的計劃 預(yù)定日期。 4.4 校準結(jié)果的審批及記錄保存：每次校準的結(jié)果須及時送交科質(zhì)量負責人審閱簽字予以核準。校準記錄須 妥善保存直至設(shè)備報廢。 校準涉及的文件： 5.1 校準方法文件：cal-s