1、3、氨基轉(zhuǎn)換反應(yīng)的定性鑒定,學(xué)習(xí)一種鑒定氨基轉(zhuǎn)換反應(yīng)的簡便方法 掌握紙層析的原理和操作技術(shù) 體外氨基轉(zhuǎn)換反應(yīng)原理,實驗原理,轉(zhuǎn)氨酶能催化 -AA的氨基與 -酮酸的-酮基互換，生成一種新的氨基酸和新的-酮酸，這種反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨作用。它在體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解等中間代謝中，在糖、脂肪、蛋白質(zhì)之內(nèi)物質(zhì)代謝的相互關(guān)系、相互轉(zhuǎn)化上都起著重要作用。 任何一種氨基酸的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)都由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，其最適pH接近7.4。其中Glu-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活力最強。當機體發(fā)病時，如肝炎、心肌梗塞等，血清中轉(zhuǎn)氨酶活力顯著增加。測定轉(zhuǎn)氨酶活性的方法有分光光度法、紙上層析、光電比色法。 為防止丙酮酸被組織

2、中其它酶氧化或還原，可加碘乙酸或溴乙酸以抑制酵解或氧化作用。,氨基轉(zhuǎn)換反應(yīng),試管號 酶液 15%三氯乙酸 1%Glu 1%丙酮酸 0.1%碳酸氫鉀 0.05%碘乙酸 1 10d 10d,10min 10d 10d 10d 5d 2 10d 10d 10d 10d 5d,37-40反應(yīng)1.5小時，經(jīng)常搖動確保反應(yīng)進行完全。保溫后取出第2號試管，加入15%三氯乙酸10d，沉淀蛋白終止反應(yīng)。將兩只試管中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到離心管中，2500rpm/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到干凈的試管中備用。,紙層析檢測原理,濾紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。濾紙的成份是纖維素，纖維素的 OH基為親水性基團

3、，因此可吸附一層水或其它溶劑作為固定相。通常把有機溶劑作為流動相。當將溶質(zhì)樣品(被分離物)點在濾紙的一端后，該物質(zhì)溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶劑分子的固定相中，有機溶劑自下而上移動，稱為上行層析。流動相流經(jīng)支持物時與固定相對溶質(zhì)進行連續(xù)的抽提，物質(zhì)在兩相間不斷分配的結(jié)果即得到分離。,紙層析檢測,紙層析是以濾紙為載體，用一定的溶劑系統(tǒng)展開而達到分離、分析目的的層析方法。此法可用于定性，亦可用于分離制備微量樣品。,20ml展層劑飽和20min,點樣,展層2小時左右,顯色,Rf值的定義,物質(zhì)分離后在圖譜上的位置，可用比移值 Rf來表示，Rf值的定義是：從溶質(zhì)層析的起點(原點)到層析斑點中心的

4、垂直距離與從原點到溶劑流動的前沿的垂直距離的比值： Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離 兩相體積比在同一實驗情況下是不變的，所以 Rf值的主要決定因素是分配系數(shù) ()。對于每一物質(zhì)在一定條件下值是固定的，因此Rf值為其特征常數(shù)，可做為定性鑒定的參考數(shù)值。,影響 Rf值的主要因素,1.物質(zhì)結(jié)構(gòu)對于Rf值的影響 2.溶質(zhì)與溶劑間的相互作用對Rf值的影響 3.pH對Rf值的影響 4. 濾紙對Rf值的影響 5.溫度對Rf值的影響,轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的定性鑒定原理,無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法 (如核苷酸類物質(zhì)用紫外光照射)或顯色法鑒定。氨基酸紙上層析圖譜常用的顯色劑有茚三酮、吲哚醌。 本實驗采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應(yīng)受溫度、pH，時間影響較大。如果要使結(jié)果重復(fù)，必須嚴格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會使氨基酸不顯出顏色。樣品中含大量鹽時顯色點上會出現(xiàn)白斑，空氣中其它的雜質(zhì)如氨，硫化氫或酚等皆會影響顯色結(jié)果。銅離子可以與氨基酸-茚三酮顯色物形成絡(luò)合物，顏色較穩(wěn)定，用硫酸銅乙醇溶液洗脫層析后的顯色斑點，可以通過比色法定量測定氨基酸含量。,轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的定性鑒定原理,37保溫1.5小時,氨+還原茚三酮,氨