1、實驗八 SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì),一、目的要求,1.學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù) 2.學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離鑒定蛋白質(zhì)技術(shù),二、原理,電泳：帶電質(zhì)點在電場作用下，會向兩極移動；帶正電荷的移向負極，帶負電荷的移向正極，這種現(xiàn)象稱為電泳。 氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、激素、核酸及其衍生物等物質(zhì)都具有許多可解離的酸性和堿性基團，它們在溶液中會解離而帶電。一般說來，在堿性溶液中（即溶液的pH值大于等電點pI），分子帶負電荷，在電場中向正極移動。而在酸性溶液中，分子帶正電荷，在電場中向負極移動。移動的速度取決于帶電的多少和分子的大小。 不同的質(zhì)點在同一電場中泳動速度不同，常用泳動度（

2、或遷移率）來表示。泳動度的定義是帶電質(zhì)點在單位電場強度下的泳動速度。,泳動度（或遷移率）首先取決于帶電質(zhì)點的性質(zhì)，即質(zhì)點所帶凈電荷的量、質(zhì)點的大小和質(zhì)點的形狀。一般來說，質(zhì)點所帶凈電荷越多，質(zhì)點直徑越小，越接近于球形，則在電場中的泳動速度越快；反之，則越慢。 泳動度除受質(zhì)點本身性質(zhì)的影響外，還受其他外界因素的影響。 影響泳動速度的主要外界因素有溶液的粘度、電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度、電滲現(xiàn)象,表 電泳技術(shù)的種類,聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫

3、酸銨(簡稱AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。,聚丙烯酰胺凝膠有下列特性： (1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好； (2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶； (3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定； (4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好； (5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g (6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠

4、的孔徑； (7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。 表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6,聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完

5、全相同。,圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)(1)樣品膠pH6.7 (2)濃縮膠pH6.7 (3)分離膠pH8.9 (4)電極緩沖液pH8.3,圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖3 凝膠模示意圖1.樣品槽模板 2.長玻璃板 1.導(dǎo)線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng),返回,不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2

6、種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。,（1）樣品濃縮效應(yīng) (a)凝膠孔徑不連續(xù)性： (b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性； 在pH6.7的凝膠緩沖體系中 前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度) 當進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)； （c)電位梯度的不連續(xù)性： (2)分子篩效應(yīng) (3)電荷效應(yīng),圖4 電

7、泳過程示意圖A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。,圖5 不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。因此可以利用SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量。,在蛋白質(zhì)溶液中加入巰基乙醇后，巰基

8、乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使蛋白質(zhì)分成單個亞單位； SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。由于SDS帶有大量負電荷，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，使各種蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷。 SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度一樣，約為18，而長軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比地變化。 由于蛋白質(zhì)的遷移率與蛋白質(zhì)的凈電荷量(q)成正比，與蛋白質(zhì)在溶液中的摩爾系數(shù)(f)成反比(f由介質(zhì)的粘滯性、蛋白質(zhì)分子的大小和形狀決定)，而不同的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負電荷，并具有相同形狀；因此在一定濃度的

9、凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。,三、試劑與器材 試劑：10%SDS、 凝膠貯液（30ACr-0.8%Bis)、分離膠緩沖液（3.0 mol/L pH8.9TrisHCl 緩沖液）、 濃縮膠緩沖液（ 0.5 mol/L pH6.7TrisHCl 緩沖液）、10%過硫酸銨、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly電極緩沖液、 1%瓊脂糖溶液、0.05考馬斯亮蘭R250 、7%醋酸 器材：雙垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 、脫色搖床,五、 操作方法 1.制備膠板前的準備 將平、凹玻璃板和邊條如下圖安裝在制膠架上。 在制膠架底部的密封槽內(nèi)加入已融化的1%瓊脂(糖)

10、。其目的是封住兩塊玻璃板底部間的空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應(yīng)避免有氣泡。在邊條與玻璃板的縫隙的外側(cè)也滴加少量的瓊脂糖。 待瓊脂糖凝固后即可灌膠。,2 配膠 表 SDS不連續(xù)體系凝膠的制備 配制 8 mL不同濃度的分離膠 配制4 mL濃縮 試劑名稱 所需試劑用量/mL 所需試劑用量/mL 7.5% 3% 凝膠貯液 2.00 0.4 分離膠緩沖液 (pH8.9 Tris-HCl) 1.00 濃縮膠緩沖液 (pH6.7 Tris-HCl) 0.50 10%TEMED 0.05 0.02 10SDS 0.08 0.04 重蒸水 4.82 3.00 混勻后，置真空干燥器中，抽氣10 min 10%過硫酸

11、銨 0.05 0.04 混勻后灌膠,3. 制備凝膠板 將混合后的分離膠溶液，用細長頭的滴管或直接倒入平、凹玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1 cm。用1 mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約34 mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。 約30-60 min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。 將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細長頭的滴管或直接倒入玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5 cm處，輕輕加入樣品槽模板。靜置電泳槽，10 min左右，上膠即可聚合，再放置10-20 min。 將凝膠板從制膠架中取下安裝到電泳槽上，在凹板口邊緣與電泳

12、槽之間封一些瓊脂糖。加入電極緩沖液，使液面沒過凹玻璃板約0.5 cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。,4. 樣品的處理及加樣 將樣品按0.51 mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時迸出)，在100沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。 用微量進樣器取10-30 l上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。 （樣品溶解液：內(nèi)含1% SDS，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍，0.01 mol/L pH6.7 Tris-HCl 緩沖液）,5 .電泳 將電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接，接通冷卻水，

13、打開電泳儀開關(guān)，開始時電流為10 mA，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至20-30 mA，當溴酚藍染料距硅膠框1 cm時，停止電泳，關(guān)閉電源及冷卻水。 6 .染色與脫色 電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記。加入染色液染色1-2 h，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可觀察結(jié)果及計算相對遷移率。,7. 結(jié)果處理 1）觀察記錄電泳結(jié)果 2）量出加樣端距溴酚蘭的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR: 相對遷移率mR=,蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm) 溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)

14、,六、注意事項 （1）用瓊脂(糖)封底及灌膠時不能有氣泡，以免電泳時影響電流的通過。 （2）加樣時樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡，可用注射器針頭挑除。 （3）如加樣孔界限不是很清晰，可在樣品梳取出前用記號筆做上記號。 （4）電泳儀不能空載。 （5）電泳時不要用手接觸電極緩沖液,七、思考題 (1)為什么要在樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蘭的作用分別是什么？,聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點 1原理 聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(Isoelectric Focusing-PAGE，簡稱IEF-PAGE)：利用各種蛋白質(zhì)pI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrier ampholytes)，兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。在電場作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動，當遷移至pH值等于pI處時，就不再泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶