1、,多糖的電泳和層析技術(shù),多糖的化學(xué)性質(zhì),多糖（polysaccharide） 糖鏈 高分子碳水化合物,多糖：相同的單糖組成 eg淀粉、纖維素和糖原,雜多糖：不同的單糖組成 eg阿拉伯膠和肝素,1.一般不溶于水 2.無甜味 3.不能形成結(jié)晶 4.無還原性和變旋現(xiàn)象,多糖的藥理作用,polysaccharide,抗腫瘤 抗病毒 降血糖 抗炎 抗補(bǔ)體,電泳技術(shù),層析技術(shù),多糖的電泳技術(shù),多糖分子在一定pH值的緩沖體系中也會(huì)解離帶電，帶電的離子在電場 的作用下向一定的方向泳動(dòng)，電荷和分子大小決定了分子泳動(dòng)速率，根據(jù)泳動(dòng)速率的不同即可分離多糖。多糖研究中用到的電泳方法主要有紙電泳、醋酸纖維膜電泳、凝膠電

2、泳、毛細(xì)管電泳四種。,多糖電泳技術(shù)的原理,多糖的電泳技術(shù)紙電泳,紙電泳原理,紙電泳是根據(jù)電泳現(xiàn)象在滲透了緩沖液的紙上加上電場使物質(zhì)移動(dòng)的電泳技術(shù)，根據(jù)支持物材質(zhì)不同可分為濾紙電泳和玻璃纖維紙電泳兩種。電泳采用的緩沖液以硼酸鹽較普遍，因糖類物質(zhì)中的相鄰羥基易與硼酸離子結(jié)合，生成硼酸復(fù)鹽，增加了電導(dǎo)性。,多糖的電泳技術(shù)紙電泳,濾紙電泳操作步驟,玻璃纖維紙電泳操作步驟,5cm20cm 玻璃纖維紙,800V電泳40分鐘,自然晾干，茴香胺硫酸溶液噴霧染色,100烘烤15分鐘 顯棕黃色,載玻片線形點(diǎn)樣,多糖的電泳技術(shù)醋酸纖維膜電泳,醋酸纖維膜電泳的原理,醋酸纖維素膜電泳是以醋酸纖維素膜為介質(zhì)，其電泳原理與

3、紙電泳基本相同。醋酸纖維素是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙?；?，溶于丙酮后可涂布成均一的微孔薄膜，即醋酸纖維素膜。,多糖的電泳技術(shù)醋酸纖維膜電泳,醋酸纖維膜電泳操作步驟,2cm8cm 醋酸纖維薄膜,緩沖液,取出膜條 夾在兩層濾紙內(nèi)吸去多余的緩沖液,浸泡15min,1mm5mm薄膜,浸漬樣品溶液約1L,緊貼在離膜條一端2cm處點(diǎn)樣,250V，電泳20分鐘,晾干，甲苯胺藍(lán)溶液染色,90%的乙醇漂洗,多糖處為藍(lán)色色斑,多糖的電泳技術(shù)凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,多糖的PAGE原理,由于多糖的分子量較大，高分離膠的濃度才能使線性酸性多糖分子像

4、球狀蛋白分子一樣在電場的作用下實(shí)現(xiàn)分離，因此分離膠濃度一般選用7.5%8%。多糖復(fù)合物的解離程度較微弱，電荷密度低又具有糖單元不均一性、不對稱性，以致多糖的電泳帶中呈帶狀分布，帶狀越明顯，說明多糖的單元成分和結(jié)構(gòu)就越復(fù)雜。,凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,判斷海洋硫酸多糖相對分子量大小和分布情況,1.配制緩沖液 （1）分散緩沖液：硼酸3.09g， Tris 6.15 g， EDTA 1.86 g，加水溶解，定容至500 ml（pH 8.3） （2）上層緩沖液：甘氨酸46.92 g， Tris12.12 g，加水溶解，定容至500 ml （3）分離膠緩沖液：丙烯酰胺10 g， 亞甲雙丙烯

5、酰胺1.0 g， 蔗糖7.5g，用pH 8.3分散緩沖液溶解，定容至50 ml （4）濃縮膠緩沖液：丙烯酰胺2.375 g， 亞甲雙丙烯酰胺0.125 g，溶于40 ml分散緩沖液中，用0.1 mol/ L 鹽酸調(diào)pH 6.3，定容至50 ml 2.制膠 （1）分離膠緩沖液6 ml、10%APS 36l、TEMED 6l制成分離膠 （2）濃縮膠緩沖液2 ml、10% APS 60l、TEMED 2l制成濃縮膠 3.海洋硫酸多糖供試品上樣 CHS1、CHS2、DPS和GAS各上樣6g,凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,200 V、溫度25電泳2小時(shí),0.5%的阿利新藍(lán)溶液,水脫色,幾種海洋

6、硫酸多糖的PAGE 電泳圖譜均呈帶狀分布 從而可看出其相對分子量呈連續(xù)分布,1.CHS2；2.對照品肝素；3.低分子肝素；4.CHS1；5.DPS；6.GAS,凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,譜圖經(jīng)圖象掃描分析軟件處理后可得到數(shù)字化圖譜，求得CHS1、CHS2、DPS 和GAS的相對分子量分布分別為3 000 10 000、6 200 8200、4 000 7 400、3 100 7 700。,凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳的原理,多糖的瓊脂糖凝膠電泳也是依據(jù)電荷密度和分子量差異進(jìn)行分離，制膠濃度在0.5%1.2%之間，上樣量35l（約含110g多糖），電泳后用甲苯胺藍(lán)溶液染色

7、，值得注意的是，因甲苯胺藍(lán)不易使中性糖染色，樣品以酸性多糖為宜。,幾種多糖電泳技術(shù)的比較,其他多糖電泳技術(shù),毛細(xì)管電泳的原理,毛細(xì)管電泳（CE）具有快速、高效和高靈敏度、所需樣品少等特點(diǎn)。CE是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳主要用于分析多糖中的單糖組分。其操作的一般過程為水解多糖樣品，水解產(chǎn)物與混合標(biāo)準(zhǔn)多糖分別進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后取產(chǎn)物進(jìn)入高效毛細(xì)管電泳分析，得出的樣品圖譜和標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對。,另外兩種常用的多糖電泳技術(shù),1 mol/L H2SO4 1 mL 100封管水解10mg GBSP 6小時(shí)，冷卻后，30

8、00 r/min離心5 min，取上清液，BaCO3中和5000 r/min離心10 min，取上清50L 待衍生。取樣品上清50L 和標(biāo)準(zhǔn)單糖各10 mg，加入40L 衍生劑，80 衍生1小時(shí)，加500L 三氯甲烷及500L 雙蒸水，混勻，6000 r/min離心15分鐘，取上清用于高效毛細(xì)管電泳分析。電泳緩沖液為pH10.2 的50 mmol/L硼砂緩沖液，電壓16 kV，毛細(xì)管：50m （id）27cm；UV：254nm。,1.L-鼠李糖；2.葡萄糖；3.4-D-甘露糖；4.D-半乳糖；5.GBSP,如銀杏白果多糖（GBSP）的成分分析,另外兩種常用的多糖電泳技術(shù),等電聚焦電泳是PAGE

9、電泳的一種特殊方法，以兩性電解質(zhì)為載體，在電場中逐步形成pH梯度，電泳時(shí)把具有兼性離子電解質(zhì)的生物樣品聚焦，達(dá)到等電狀態(tài)相應(yīng)有效pH梯度時(shí)，利用凝膠的抗對流作用使其不被擴(kuò)散，達(dá)到分離目的。在多糖分離中針對的是酸性多糖樣品，根據(jù)酸性多糖解離度不同而實(shí)現(xiàn)分離。,等電聚焦電泳的原理,多糖的層析技術(shù),層析技術(shù)是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差異，造成混合物中各組分距離不等的遷移，從而達(dá)到分離的目的。多糖研究中常用的有紙層析、柱層析。,多糖的層析技術(shù)紙層析,多糖經(jīng)酸（硫酸或鹽酸）水解成單糖，再進(jìn)行紙層析 （1）常用的溶劑系統(tǒng) 粘多糖：0.067

10、mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.4） 直鏈淀粉：75%異丙醇（V/V）：乙醇=9：1（V/V） （2）斑點(diǎn)的檢出 1）鑒定直鏈淀粉用苯胺一鄰苯二甲酸試劑 2）鑒定還原性多糖用Sornogyi試劑 3）鑒定粘多糖用甲苯胺藍(lán)試劑 4）鑒定淀粉用1%碘乙醇溶液,多糖的層析技術(shù)柱層析,纖維素柱層析,陰離子交換柱層析,凝膠柱層析,親和層析,氣相層析,高效液相層析,柱層析 纖維素柱層析,纖維素柱層析中的載體是纖維素。先用乙醇液將柱內(nèi)纖維素平衡好，然后多糖混合物沉淀于惰性的纖維素上面。用不同濃度乙醇水溶液（如80%，60%，40% ，20%）階梯洗脫，不同多糖就依次洗脫出來。先洗脫的是分子量最小的多糖，最終

11、洗脫的是分子量最大的多糖。,纖維素柱層析的原理,柱層析陰離子交換柱層析,陰離子交換柱層析的原理,陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖及粘多糖，是目前多糖純化中應(yīng)用最普遍的一種方法，特別是對于體積較大的多糖溶液，大多首先采用陰離子交換柱層析進(jìn)行濃縮及初步純化,柱層析陰離子交換柱層析,多糖的分離純化,（1）流速過慢 （2）柱床高度會(huì)隨緩沖液濃度及pH的改變而改變 （3）穩(wěn)定性差 （4）使用壽命短,原因在于：,化學(xué)穩(wěn)定性好、流速快的Sepharose FF,柱層析陰離子交換柱層析,DEAE-32纖維素柱層析分析蟲草多糖組分,DEAE-32 纖維素層析柱的制備：DEAE-32 纖維素粉溶脹漂洗

12、3 次 1mol/L NaOH浸泡4h 蒸餾水洗至中性 1mol/L HCl 浸泡4h 蒸餾水洗至中性重復(fù)35 次裝柱平衡加樣洗脫（速度為5ml/10min）,冬蟲夏草胞外多糖蒸餾水洗脫曲線,冬蟲夏草胞內(nèi)多糖蒸餾水洗脫曲線,柱層析凝膠柱層析,一、葡聚糖凝膠 (Sephadex) 二、修飾葡聚糖凝膠 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝膠 （Bio-Gel P） 四、瓊脂糖類凝膠 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝膠（hydrophobic gels）,柱層析親和層析,某些特定多糖具有和某些專一分子可逆結(jié)合的特性，如刀豆球蛋白能專一地與分支多糖結(jié)合。把ConA作為配基，與不溶性載體結(jié)合使其固定化，裝入色譜柱（親和柱），然后把含有欲分離的多糖溶液作流動(dòng)相，這時(shí)溶液中只有能和配基具有親和力的多糖分子被結(jié)合而吸附，其他多糖則流出柱外，然后再改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度及pH，使配基與多糖解離，則實(shí)現(xiàn)了多糖的分離純化,總結(jié),多糖結(jié)構(gòu)的多樣性及其引起的功能復(fù)雜性，給多糖的研究工作帶來巨大的困難，多糖的分離純化及分析鑒定的方法進(jìn)展較為緩慢。對于一種多糖的分離純化，需要綜合運(yùn)用不同的分離純化技術(shù)，才能較全面地表征某種多糖的性質(zhì)