1、血片制作和染色,李金鳳 平樂縣中醫(yī)醫(yī)院,人體瘧原蟲的基本結構,細胞漿 隨蟲體發(fā)育長大，細胞漿逐漸增多。間日瘧原蟲發(fā)育到大滋養(yǎng)體階段，胞漿呈阿米巴樣活動，胞漿內有空泡。 核 鮮紅色，呈圓形或不規(guī)則的顆粒狀。核的結構致密，只有在個別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。有時因胞漿厚密或染色深藍，使核呈暗紅或紫紅色。,人體瘧原蟲的基本結構,瘧色素 不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異。間日瘧原蟲的色素顆粒呈細小桿狀，黃褐色；惡性瘧原蟲色素呈塊狀，黑褐色；三日瘧原蟲的色素呈砂粒狀，深褐色；卵形瘧原蟲的色素與間日瘧原蟲相似。瘧色素在蟲體內散在分布或聚集成團塊。,設 備,載玻片 新玻片 把玻

2、片浸入有液態(tài)洗滌劑清水中1020分鐘，然后用干凈棉巾逐個擦拭，再放入盛有清水的容器中換水34次，涼干，最后用干凈柔軟的棉巾將玻片擦亮。 用于特殊目的玻片，上述處理后將玻片浸在95乙醇510分鐘，再擦干擦亮。,設 備,舊玻片 將玻片浸泡于洗滌劑溶液中12天，或浸泡于煮沸的5肥皂水12小時，再移到新配置的洗滌劑溶液中12小時，擦去玻片上的血痕，用清水漂洗34次，再將玻片擦干擦亮。 玻片包裝 洗凈的玻片每1020張用白紙包好放入塑料袋內，保存于干燥環(huán)境中備用。,設 備,采血針 使用一次性采血針。 玻片盒 為防止污染和蒼蠅吸食血膜，新血片應放在玻片盒內，厚血膜要保持水平，直到充分干燥。 75乙醇棉球

3、用于采血前后消毒。 記號筆 用于記錄血片號碼。,試 劑,染色液種類 以堿基美藍液和酸性伊紅液混合的多色性染劑（美蘭、伊紅和由美蘭氧化所成的天青）配制的多色性染液分為兩類： 水溶液：羅氏（Romanowsky）染液、西氏（Simon)、J.S.B氏染液、費氏(Field)等； 醇溶液：吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液、利氏（Leishman）等。,試 劑,染色原理 伊紅是酸性水溶性鈉鹽，美蘭是堿性水溶性鹽酸鹽，當它們各自溶化水中時，就離解為帶陽電和陰電的離子。伊紅主要離解為酸性的陽離子，在遇到堿性的蛋白質（如血紅蛋白、嗜伊紅白血球顆粒等）可結合成不易溶于水的沉淀物染成紅色。美蘭

4、主要離解為堿性的陰離子，美蘭與瘧原蟲、淋巴和大單核細胞的胞漿、嗜堿性白細胞的顆粒等酸性蛋白質結合染成蘭色。,試 劑,吉氏（Giemsas）染液配制 吉氏粉 5.0 g 甲醇 250ml 甘油 250ml 將吉氏粉置于研缽中，加入少量甘油充分研磨，然后邊加邊磨，至加完甘油倒入500ml有塞玻璃瓶。在研缽中加入少量甲醇洗掉剩余部分倒入瓶內，再加甲醇洗靜研缽中甘油。塞緊瓶塞，充分搖勻，置室溫內，每天用力搖動溶液5分鐘，3天后即可使用。,試 劑,瑞氏（Wrights）染液配制 瑞氏染劑粉 1.0 g 甲醇 500ml 甘油 15ml 將瑞氏染劑粉置于研缽內，加入甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用甲

5、醇洗研缽中的甘油，溶液倒入瓶中，搖勻后，置室溫下，每天搖動5分鐘，3天后即可使用。,試 劑,染色用水 常用的染液稀釋和沖洗用水是中性蒸餾水或經(jīng)煮沸過濾的冷開水。在沒有蒸餾水時，也可用井水、河水、泉水或雨水。稀釋和沖洗用水的pH值在7.0-7.2染色效果最佳。也可選用臨時配制的PBS緩沖液，作為稀釋和沖洗用水。,試 劑,PBS緩沖液配制（0.01 mol/l PBS pH7.2） KH2PO4 0.38g NaHPO4 1.02g(或Na2HPO4 12H2O 2.58g) NaCl 8.00g 蒸餾水加至 1 000ml,血片制作,取血時機 現(xiàn)癥病人隨時取血，瘧疾普查不考慮取血時機。但在診斷或

6、需要某期瘧原蟲作標本時，應掌握適宜的取血時機。 一般患者發(fā)作數(shù)小時至十小時內，可見環(huán)狀體,1236小時發(fā)育至滋養(yǎng)體，36 48小時可見裂殖體，發(fā)作二次可見配子體。 惡性瘧原蟲裂體生殖在內臟毛細血管內進行，發(fā)作前末稍血液中不易查到。較理想的取血時間是在發(fā)作后20小時左右，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲。,采血部位和方法 通常耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。,厚血膜用右手大拇指和食指夾持推片兩側中部，用推片左下角從取血部位刮取約45l血，使血滴與載玻片接觸再由里向外一個方向旋轉24

7、圈，涂成直徑0.81圓形厚血膜。 薄血膜用推片中部取血11.5l，將推片與載玻片2535度角接觸，當血液在兩側擴展至約2 寬時，迅速向前推成長2.5 舌狀薄血膜。,厚、薄血膜的位置,厚薄血膜標本片,厚血膜血量適宜，不宜過多或過少。 薄血膜無皺折和空泡，紅細胞單層排列。,染 色,吉氏染色 先用甲醇固定薄血膜。成批染色時，將血膜朝一方向插入染色缸中，倒入新配制2吉氏染液浸沒厚薄血膜染色30分鐘，向染色缸中緩慢注入自來水至溢出，將染色缸中殘余染液傾出，再加入新水反復沖洗23次，然后取出血片，將血膜朝下插在晾片板上晾干。單張血膜染色 可取蒸餾水或PBS緩沖液2ml加入吉氏染液12滴，混勻后滴在厚薄血膜

8、上染色20 30分鐘，再按上述方法水洗、晾干。,快 染,配制5%吉氏染液 在2ml緩沖液或凈水中直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴到待染標本的厚薄血膜上，染色10min，清水緩慢沖洗，晾干鏡檢。,影響染色效果的因素,血片 玻片清潔，血膜制作質量。 染劑和溶劑 染料溶劑質量影響染液酸堿度。 染液 新配制染液染色力較弱且常呈堿性。 染液濃度 染液濃度高，著色快，著色深；濃度低，著色慢，但各種細胞內部結構著色均勻、清晰。 染色時間 溫度高，著色快，染色時間短；溫度低，著色慢，染色時間適當延長。,影響染色效果的因素,稀釋和沖洗用水PH值 稀釋和沖洗用水PH偏低，染色偏紅；PH偏高，染色偏藍。 沖洗方法 染

9、色后將玻片連同染液一起放在水中緩慢漂洗，或沿玻片及染色缸邊緣緩慢加水，使染液表層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污血膜。,染色效果的判定,染色著色較好的血膜，紅細胞呈淡紅色，嗜酸性細胞的顆粒呈鮮紅色，淋巴細胞及瘧原蟲胞漿呈蘭色或淡藍色，白細胞核呈紫藍色，瘧原蟲核呈紅色。,血片制作染色注意事項,1.編號 血膜制成后用蠟筆在玻片上寫受檢者號碼，待薄血膜干后用鉛筆于薄血膜上寫受檢者的號碼。 2.推片 制血片時手指持玻片邊緣，不接觸玻片表面。用作推片的玻片邊緣要平滑。 3.新血片存放 剛涂制的血膜平放在標本盒內，防塵、防蒼蠅、蟑螂吮吸血膜，血膜干后蓋嚴標本盒。新木制標本盒不能馬上存放標本，以免厚血膜血紅蛋白被木醇固定。,血片制作染色注意事項,4.未染色血片存放 血膜自然干透后用甲醇固定薄血