1、,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容,文庫(kù)構(gòu)建技術(shù),亞克隆技術(shù),PCR/RT-PCR 同源克隆,基因組DNA提取 質(zhì)粒DNA提取,RNA提取,酶切、脫磷、 連接,感受態(tài)細(xì)胞制備、 轉(zhuǎn)化,cDNA加街頭、磷酸化 cDNA插入載體,mRNA純化 cDNA一、二鏈合成,生物大分子提取,PCR擴(kuò)增 RT-PCR擴(kuò)增,PCR片段純化 PCR片段克隆,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容,分子標(biāo)記技術(shù),原核表達(dá)和 分子雜交技術(shù),SSH,DD-PCR,RAPD SSR,AFLP,基因差顯技術(shù),探針標(biāo)記 Southern雜交,誘導(dǎo)表達(dá) SDS Western雜交,7.10 質(zhì)粒DNA提取堿解法 DNA的酶切技術(shù)

2、 DNA酶切片段脫磷技術(shù) 7.11 基因組DNA提取 DNA片段的重組連接技術(shù) 受體菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 7.12 總RNA的提取 mRNA的提取及純化 7.13 PCR/RT-PCR擴(kuò)增 18sRNA片段 PCR片段回收 PCR片段克隆,7.14 cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù) - cDNA鏈合成、接頭連接 SSH - cDNA鏈的合成、酶切、接頭連接 7.15 cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù) -磷酸化 、載體連接 SSH- 液液雜交 DD-PCR RAPD 7.16 cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)-遺傳轉(zhuǎn)化 SSH-兩輪PCR擴(kuò)增 SSR AFLP-酶切、連接 Southern雜交-電泳轉(zhuǎn)膜、探針標(biāo)記 原核表達(dá)-誘導(dǎo)表達(dá)

3、,7.17 AFLP兩輪PCR擴(kuò)增 Southern雜交 -預(yù)雜交、雜交 Western雜交 -電泳、轉(zhuǎn)膜 7.18 Southern雜交-bloting Western雜交- bloting 測(cè)序膠電泳 7.19 測(cè)序膠電泳,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,DNA提取,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,DNA提取原則,DNA結(jié)構(gòu)完整 不存在對(duì)酶有抑制作用的物質(zhì) 排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染 蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度 無(wú)其他核酸分子的污染,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,DNA的提取方法,染色體DNA的提取 CTAB法 SDS法 質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法 煮沸法 線粒體、葉綠體DNA的提取 差速離心結(jié)合SDS裂解法,中

4、國(guó)農(nóng)科院研究生院,基因組DNA提取,原理： 熱裂解 試劑作用 : NaCl, SDS, EDTA, Tris-HCl 試驗(yàn)材料： 植物葉片，菌體，菌絲等。 方法步驟：A. 預(yù)處理：清洗、剪切、研磨； B. 液氮降溫，研磨； C. 裂解，高溫/低溫； D. 純化：蛋白（苯酚，酚仿，氯仿），RNA； E. 溶解，定量（電泳/比色），檢測(cè)，保存。 電 泳 0.50.6ARGAROSE； 比 色 50ug/ml DNA; OD260/OD280=1.8， 40 ug/ml RNA; OD260/OD2801.8。,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,動(dòng)植物材料0.5g(鮮組織) 液氮,研碎 600ul裂解液/60ul

5、酚 65/30min 加入等體積氯仿,輕搖混勻 離心(12000-15000rpm, 15min ) 上清液 靜止下 0.6V冷異丙醇 2V無(wú)水乙醇, 0.1V乙酸鈉 0.1V乙酸鈉 室溫靜止5min -70 ,20min 挑取絮狀漂浮物 離心（10000g,10min) 離心沉淀?xiàng)壱后w取沉淀 取沉淀 70%乙醇洗滌,真空干燥, 復(fù)溶于40ul水(65 ),動(dòng)植物基因組DNA提取,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,注意事項(xiàng)： 1,裂解液要預(yù)熱 2,各操作步驟要輕柔 3,取各上清時(shí),不應(yīng)貪多 4,異丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要預(yù)冷,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,質(zhì)粒DNA提取,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,37 200rpm

6、搖菌過(guò)夜 1ml菌液 離心 8000rpm/2min 取沉淀 預(yù)冷的100ul Solution , 振蕩懸浮 200ulSolutionII,顛倒、冰浴3-5min, 150ul預(yù)冷Solution III，混勻, 冰浴5min 離心,12000rpm,5min 等體積（酚/氯仿）、氯仿抽提各一次 離心 10000g 4min,取上清 2V的乙醇/0.1V乙酸鈉 -70,10-20min 離心 10000g 10min 取沉淀 70%乙醇洗沉淀 冷凍干燥 復(fù)溶于30ldd水,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,北京市清華大學(xué)附屬中學(xué),注 意,起始菌 試劑作用,有機(jī)溶劑抽提 沉淀,大質(zhì)粒和G+,嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒,中

7、國(guó)農(nóng)科院研究生院,RNA提取及分析鑒定 RNA提取方法 RNA提取注意事項(xiàng) RNA提取鑒定及常見(jiàn)問(wèn)題分析,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,分離提純RNA的目的 定性、定量不同發(fā)育時(shí)期基因的時(shí)空表達(dá)及其差異 克隆新基因 研究基因的拼接 獲得生成蛋白產(chǎn)物的模板 動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)Northern雜交模板 構(gòu)建cDNA文庫(kù) 分子標(biāo)記模板cDNA-AFLP,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,RNA的性質(zhì) 不穩(wěn)定性 核糖殘基的2和3位置帶有羥基，RNA易于被 RNA酶切割水解 RNA酶含量豐富，不易失活 穩(wěn)定性 剛性弱，抗機(jī)械振蕩 酸溶性好 在酸性條件下溶解于水相,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)： 樣品細(xì)胞或組織的

8、有效破碎 有效地使核蛋白復(fù)合體變性 對(duì)內(nèi)、外源酶的有效抑制 有效地將從和蛋白混合物中分離 對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,常用RNA酶抑制劑,焦磷酸二乙酯（DEPC）： 與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑 。 異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大

9、鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,提取RNA的注意事項(xiàng),全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套操作，所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染。 玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小時(shí)以上； 塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用DEPC水徹底清洗，再滅菌或用氯仿浸洗，涼干。電泳槽可用0.5M NaOH或10雙氧水浸泡2小時(shí)后，DEPC水沖洗 0.1%的DEPC水溶液處理過(guò)夜,再用蒸餾水沖凈，高壓滅菌滅活；,

10、中國(guó)農(nóng)科院研究生院,試劑用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,高壓滅菌滅活；配制的溶液如不能高壓滅菌,或含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理則應(yīng)用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開(kāi)封的試劑。 DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物 為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,RNA的提取途徑： 提取總核酸，再用氯化鋰沉淀出來(lái) 酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相 吸附柱 有機(jī)溶劑沉淀,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,RNA提取的步驟,材料的裂解,雜質(zhì)的去除,RNA的吸附或沉淀,異硫氰酸胍，亞

11、硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸 等。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。,苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使DNA及蛋白沉淀到有機(jī)相。,硅質(zhì)材料的吸附 或用異丙醇沉淀濃縮RNA。 經(jīng)DEPC 處理的水溶解RNA,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,材料準(zhǔn)備及裂解,盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長(zhǎng)較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提。 組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位, 細(xì)菌和酵母需要?jiǎng)驖{處理。 對(duì)不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲(chǔ)存液中保存。 液氮研磨時(shí)不要使液氮揮發(fā)凈，隨時(shí)補(bǔ)充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。,RN

12、A的提取,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,雜質(zhì)的抽提,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,RNA的沉淀和溶解,含RNA的水相過(guò)吸附柱，通過(guò)去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質(zhì) 或使用異丙醇沉淀RNA應(yīng)充分的混勻并放置10min左右離心收集沉淀，70乙醇洗滌，晾干 用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水或?qū)ｉT的試劑來(lái)洗脫或溶解RNA 樣品收集后或需長(zhǎng)期保存時(shí)應(yīng)置于70 或加入RNase抑制劑，分裝使用,RNA的提取,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,RNA的檢測(cè),電泳槽系統(tǒng)的處理 乙二醛化瓊脂糖凝膠電泳 含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳 RNA純度及濃度的檢測(cè) （A260=1 ，約40 g/ mL RNA； A260/A280 約為1.9-2.1 ）,中國(guó)農(nóng)科院

13、研究生院,1 抽提過(guò)程不徹底存在蛋白或多糖多酚的污染 2 DNA 的污染 3 離子濃度較高,原因,對(duì) 策,1 保證徹底的裂解和一定轉(zhuǎn)數(shù)一定時(shí)間的離心；增加有機(jī)溶劑抽提的次數(shù)，用吸附柱純化 2 減少處理樣品的量；加入不含RNase的DNase處理；再次純化 3 增加漂洗次數(shù),RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題,問(wèn)題一： RNA樣品不純,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,1 樣品含有雜質(zhì)雜液 2 樣品過(guò)量或樣品裂解 和勻漿不徹底 3 RNA未有效的吸附沉淀或洗脫 4 樣品RNA含量少,原因,對(duì) 策,1 去除樣品中的雜質(zhì)，離心除凈樣品中的培養(yǎng)基或儲(chǔ)存液 2 減少樣品用量；充分研磨樣品，增加裂解液的用量和裂解的時(shí)間 3 延長(zhǎng)吸附時(shí)

14、間或保證異丙醇沉淀的時(shí)間和離心時(shí)間；再次洗脫 4 重復(fù)吸附，加入肝糖等有助RNA沉淀的試劑,問(wèn)題二： RNA得率低,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,操作步驟 TRIzol試劑提取,在液氮下,研磨組織塊 待液氮揮發(fā)后,將上述分散的組織約50-100mg轉(zhuǎn)移至DEPC離心管中 TRIzol試劑600ul,充分懸浮，室溫放置10min。 0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。 4 12000rpm離心15分鐘，取上清液 上層水相吸至無(wú)菌離心管中 等體積氯仿抽提一次 等體積異丙醇，混勻，-80沉淀10分鐘。 4，12000rpm離心,10分鐘，沉淀RNA 70乙醇洗沉淀 干燥 復(fù)溶于DEPC水中，室溫放

15、置。,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,模板 樣品mRNA 1g 引物 (0.5g/l) 1l （6堿基隨機(jī)引物 或oligdt） 加水至 10l 5第一鏈緩沖液 4l 核酶抑制劑 1ul 40mM焦磷酸鈉 2l AMV反轉(zhuǎn)錄酶 1ul 加水至 20l 37C for 1hr. 2.5第二鏈緩沖液 40l， DNA聚合酶 0.5ul RNase H 0.5l 加水至 100l T4DNA聚合酶 1ul,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,10緩沖液T4DNA連接酶 1l BSA 1l cDNA 5l 連接

16、子 1l T4DNA連接酶 1l 加水至 10l b: 15保溫6-18小時(shí),中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,4X Hybridization Buffer composition: 80% formamide, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES,* pH 6.7. Dilution buffer (pH 8.3) :20 mM HEPES (pH 6.6),20 mM NaCl,0.2 mM EDTA (pH 8.0) Rsa I Hind III cDNA synthesis primer 5TTTTGTACAAGCTT30

17、N1N3,酶切 H2O 3 l ds cDNA 5 l 10X Rsa I Restriction Buffer 1 l Rsa I (10 units/l) 1 l 37C，1.5 hr 抽提 沉淀 連接頭 Tester 1-1 Tester 1-2 Component (l) (l) H2O 3.5 3.5 T4 buffer 1 1 Diluted tester cDNA 2.5 2.5 Adaptor 1 (10 M) 2 Adaptor 2R (10 M) 2 T4 ligase 1 1 Final volume 10 10 16 C 過(guò)夜 沉淀 復(fù)溶于10 l,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,

18、I次雜交 Component Sample 1(l) Sample 2 (l) Rsa I-digested driver cDNA 3 3 Adaptor 1-ligated TESTER 10 Adaptor 2R-ligated TESYER 10 4X Hybridization Buffer 4 4 Add water to volume 20.0 20.0 98C， 1.5 min；68C ， 8 hr,（6, 12) II次雜交 Rsa I-digested driver cDNA 3 4X Hybridization Buffer 1 98C， 1.5 min 加入到 Samp

19、le 1 + Sample 2 68C 過(guò)夜,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,TA 克隆,回收片段 8ul T4B 1ul T-vector 0.5ul T4ligase 0.5ul 4 過(guò)夜,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,分子標(biāo)記,分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記等后的又一種新的遺傳標(biāo)記 分子標(biāo)記直接以基因或基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為基礎(chǔ)，可覆蓋整個(gè)基因組或基因全體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、圖譜構(gòu)建、基因定位、基因克隆、分子標(biāo)記輔助選

20、擇和育種等方面,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記 RFLP（restriction fragment length polymorphism）標(biāo)記 VNTR（重復(fù)數(shù)可變串聯(lián)重復(fù)）標(biāo)記 基于PCR基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記 隨機(jī)引物的PCR標(biāo)記 RAPD ISSR（inter-simple sequence repeat） 引物序列參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的ISSR引物序列(http:/www.michael- smith.ubc.ca/services/NAPS/Primer_Sets/Primer.pdf) AP-PCR(arbitrarity primed poly

21、merase chain reaction) 引物較長(zhǎng)（1050bp），引物濃度較高；引物長(zhǎng)度不定 DAF （DNA amplification finger printing ）引物約58個(gè)堿基，引物濃度比RAPD高，在多態(tài)性程度低的品種上比較有效，但穩(wěn)定性更差,RAPDs - Random Amplified Polymophismic DNAs,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,特異引物的PCR標(biāo)記 使用的引物是針對(duì)已知序列的DNA區(qū)段而設(shè)計(jì) 長(zhǎng)度通常為18-24個(gè)核苷酸 分為SSR標(biāo)記、SCAR標(biāo)記、STS標(biāo)記、SRAP標(biāo)記、RAMP標(biāo)記、REMAP標(biāo)記、IRAP標(biāo)記、RBIP標(biāo)記和PGA標(biāo)記 SS

22、R（simple sequence repeats，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）標(biāo)記或微衛(wèi)星標(biāo)記 又被稱為序列標(biāo)記微衛(wèi)星位點(diǎn)(Sequence tagged microsatellite sites,STMS)、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（simple sequence lenth polymorphism,SSLP）,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標(biāo)記 以限制性酶切和PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的將兩種有機(jī)結(jié)合的DNA標(biāo)記主要有兩種： 先將DNA用限制性酶進(jìn)行酶切，然后再進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)其多態(tài)性的AFLP AFLP（Amplified Fragments Length Polym

23、orphism）標(biāo)記； 先對(duì)樣品DNA進(jìn)行專性化擴(kuò)增，再用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切檢測(cè)其多態(tài)性的CAPS標(biāo)記,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism),AFLP是由Zabeau發(fā)現(xiàn)，并由Vos建立（Vos, 1995; Zabeau和Vos, 1992）。,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,Silver Staining,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,Isotope DIG,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,AFLP實(shí)驗(yàn)程序1 模板DNA的酶切與連接,DNA（200ng/l）1.

24、25l Mse3單位 Pst3單位 Mse 接頭（50 pmol/l）1.0l Pst 接頭（5 pmol/l） 1.0l 10NEB Buffer2.5l 1002.5ug/l BSA0.25l ATP（10mM） 2.0l T4-DNA連接酶（3U/l）0.5l 加水至25l, 37酶切-連接4-6小時(shí)，或過(guò)夜。,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,2 DNA片段的預(yù)擴(kuò)增,取2.0l連接完成的DNA樣品，加入18l如下混合液： Mse 引物（M00，50ng/l）0.6l Pst 引物（P00，50ng/l）0.6l 10PCR Buffer2.0l Mg2+（30mMl）1.0l Taq酶（5U/l，P

25、romega，AM）0.1l dNTP（250mM）0.16l ddH2O13.54l,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,混合后，在如下PCR條件下擴(kuò)增： Step195 1分鐘 Step295 30秒 Step356 30秒 Step472 60秒 Step5GOTO step2 31循環(huán),中國(guó)農(nóng)科院研究生院,3 AFLP的選擇性擴(kuò)增,取4l稀釋的預(yù)擴(kuò)增混合液，加入16l如下反應(yīng)液： Pst引物（50ng/l）0.8l Mse引物（50ng/l）0.8l 10PCR Buffer2.0l Mg2+（30mM）1.1l dNTP（25mM）0.18l Taq酶（5U/l）0.12l ddH2O11.0l,中

26、國(guó)農(nóng)科院研究生院,混合后按如下PCR程序擴(kuò)增： Step195 2分鐘 Step295 30秒 Step365 30秒（每循環(huán)降低0.7） Step472 60秒 Step5GOTO step2 12循環(huán) Step695 30秒 Step756 30秒 Step872 60秒 Step9GOTO Step6 23循環(huán),中國(guó)農(nóng)科院研究生院,Core sequences for the primer sets EcoRI 5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3 MseI 5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3 AATTC G 接頭 EcoRI 5-CTGCTAGACTGCGTACC

27、-3 3- CTGACGCATGGTTAA- 5 MseI T AAT 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 3-TACTCAGGACTCAT-5,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,1,tissue,SDS,ProtK,Phenol Chloro,ETOH Spin,中國(guó)農(nóng)科院研究生院,Structure of DIG-Modified Nucleotides Coupled via Alkali-Stable Ether Bond堿穩(wěn)定,Formula: C43H61N4O21P3Li4 Molecular Weight: 1090.7,DIG-UTP (R1 = OH, R2 = OH) DIG-d

28、UTP (R1 = OH, R2 = H) DIG-ddUTP (R1 = H, R2 = H),中國(guó)農(nóng)科院研究生院,Non-Radioactive Labeling of Nucleic Acids 非放射性核酸標(biāo)記-酶法標(biāo)記,Klenow進(jìn)行隨機(jī)引物標(biāo)記 DNA Pol I / DNase I進(jìn)行缺口平移標(biāo)記 PCR 方法進(jìn)行標(biāo)記（Taq DNA Polymerase,/Pwo DNA Polymerase or Expand)* 寡核苷酸 3-標(biāo)記或用末端轉(zhuǎn)移酶加尾標(biāo)記DNA* 用SP6-, T3- or T7 RNAPolymerases*進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA 原位標(biāo)記(PRINS) 用AMV/M-MuLV合成cDNA C. therm/Taq, C. therm/Pwo or C.