1、腫瘤分子診斷服務(wù)介紹,2,標(biāo)準(zhǔn)化用藥,個(gè)體化用藥,標(biāo)準(zhǔn)化用藥,個(gè)體化用藥,標(biāo)準(zhǔn)療法1,標(biāo)準(zhǔn)療法2,標(biāo)準(zhǔn)療法3,3,腫瘤藥物與相關(guān)靶標(biāo),4,如何實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥？,分子分型 藥物療效,5,6,體細(xì)胞基因突變檢測,mRNA表達(dá)檢測,循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)檢測,基因多態(tài)性檢測,7,體細(xì)胞基因突變檢測,EGFR, K-RAS, B-RAF，C-KIT,8,1、基因突變檢測技術(shù), qPCR-HRM（可用于血漿標(biāo)本檢測） Taqman-ARMS（與國際獲批的技術(shù)相當(dāng)） DNA測序（基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)）,9,突變檢測技術(shù)之一 Taqman-ARMS,所有定量PCR儀均可使用。 主要用于各類組織，包括手術(shù)

2、、穿刺或鏡檢組織類。 2小時(shí)即可完成檢測 試劑盒商業(yè)化程度高，臨床認(rèn)可程度高 國內(nèi)已有試劑盒獲批SFDA,10,突變檢測技術(shù)之一 qPCR-HRM,qPCR-HRM技術(shù)是基于高效穩(wěn)健的PCR上的高分辨熔解曲線分析（High-Resolution Melting）技術(shù)，靈敏度可以達(dá)到1%-0.1%，既能檢測已知突變，也能檢測未知突變。 qPCR-HRM的突變檢測已獲國際多中心雙盲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 11, No. 6, November 2009）。,實(shí)例圖：利用HRM技術(shù)對7個(gè)樣本分別進(jìn)行EGFR（左圖）、KRAS（右圖）突變

3、檢測，紅色表示該樣本發(fā)生突變，藍(lán)色表示未突變，藍(lán)色橫直線為陰性對照。左圖顯示2個(gè)樣本發(fā)生了EGFR突變；右圖顯示4個(gè)樣本發(fā)生了KRAS突變。,EGFR,KRAS,11,血漿EGFR突變檢測： 18號外顯子：無突變 19號外顯子：突變 20號外顯子：無突變 21號外顯子：無突變 附圖,主要特點(diǎn)： 實(shí)現(xiàn)血漿中來自腫瘤的微量DNA的突變檢測。 目前所做的臨床實(shí)驗(yàn)中，血漿EGFR檢測結(jié)果與其手術(shù)標(biāo)本之間的整體符合率符合率達(dá)到91.25%。 是臨床上不能手術(shù)、也同時(shí)不愿穿刺患者的替代檢測方案；也可 獲得性耐藥進(jìn)行預(yù)先檢測。,qPCR-HRM用于血漿微量突變檢測,12,國際公認(rèn)的分子檢測金標(biāo)準(zhǔn) 有明確的物

4、價(jià)收費(fèi) 實(shí)驗(yàn)流程較復(fù)雜，需要大型儀器,突變檢測技術(shù)之一 DNA測序,13,突變檢測項(xiàng)目列舉,14,EGFR突變檢測,EGFR E19 / E21敏感突變 適合使用TKI藥物治療,耐藥位點(diǎn)檢測T790M,15,K-RAS突變檢測,16,BRAF,NCCN,2010年NCCN結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南指出： K-ras基因?yàn)橐吧投瑫r(shí)具有BRAF V600E突變的患者，靶向EGFR抗體治療無效。,BRAF-V600E檢測,腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南（中國版） 2010第一版,17,指導(dǎo)腫瘤靶向治療的靶標(biāo),18,基因多態(tài)性檢測與藥物代謝毒性 (UGT1A1,CYP,DPD),9/8/2020,19,單核苷酸多態(tài)

5、性（SNP）是最常見的基因變異,至少1%的人群,絕大多數(shù)人群,共有序列,G to C,SNP 位點(diǎn),變異的序列,最常見的基因多態(tài)性 SNP,9/8/2020,20,為什么 SNPs 重要?,個(gè)體 1,個(gè)體 2,= SNP variations in DNA,SNP標(biāo)志基因 A,基因 B,基因 A,SNP 可能使基因 B 產(chǎn)生變異的蛋白質(zhì)分子,9/8/2020,21,個(gè)體的SNP 譜,SNP 譜A,SNP 譜B,SNP 譜C,SNP 譜F,SNP 譜E,SNP 譜D,9/8/2020,22,SNP 譜有助于確定藥物的療效和副作用,乳腺癌病人,個(gè)體的SNP 譜可以分成不同的類型,SNP 譜 A,對

6、藥物有期望的反應(yīng),對藥物沒有期望的反應(yīng),SNP 譜 A 的人對藥物 有期望的反應(yīng),SNP 譜E,SNP 譜 B,SNP 譜 C,SNP 譜D,23,藥物代謝與SNP檢測,化療藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、代謝、分布和清除，通過其活性物質(zhì)對治療靶點(diǎn)的直接攻擊而發(fā)揮作用，整個(gè)過程需要多種蛋白質(zhì)/酶的共同參與和協(xié)同作用。 SNP 主要是指在基因組水平上變異頻率大于1%的單核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致不同個(gè)體體內(nèi)各種蛋白，酶活性的差異，因此導(dǎo)致藥物使用情況的不同。,24,膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因（UGT1A1）,UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28(TA)7TAA

7、: 野生型：6個(gè)TA UGT1A1*6(G211A)：,使UGT1A1的轉(zhuǎn)錄活性下降了三分之二。 導(dǎo)致對伊立替康的毒性增加。,FDA提示：UGT1A1的多態(tài)性-伊立替康的毒性增加(6TA),此型的酶活性是野生型的49 。,25,CYP19A1 多態(tài)性影響芳香化酶抑制劑療效,CYP19A1是芳香化酶的編碼基因，臨床研究已證實(shí)有著很大的影響作用。在接受芳香化酶抑制劑治療的乳腺癌患者中，攜帶CYP19A1基因rs4646（GT）突變患者的治療效果較無此突變的患者顯著2-4（下圖）。 CYP19A1 rs4646（GT）SNP是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制劑治療療效的有效預(yù)測指標(biāo)。,如圖一項(xiàng)對乳腺癌患者

8、的臨床研究顯示：CYP19A1基因rs4646突變的患者使用芳香化酶抑制劑藥物療效明顯優(yōu)于野生型患者（p0.0001）1。,參考文獻(xiàn)1. Ian ES et al. N Engl J Med. 2003;384:2431-42.2. Ramon C et al. Clin Cancer Res. 2008;14:811-6. 3. Lunardi G et al. J Clin Oncol. 2009; 27: 555. 4. Fasching PA et al. Breast Cancer Res Tr. 2008;112:89-98.,26,基因表達(dá)檢測（mRNA表達(dá)） (ERCC1BRC

9、A1TUBB3TS),27,基因表達(dá)檢測指標(biāo)（靶向藥物）,28,28,HER2基因表達(dá)檢測,采用RT-PCR方法替代FISH或免疫組化方法，臨床準(zhǔn)確率達(dá)97%以上。 主要特點(diǎn)： 客觀，不用人為觀察。 時(shí)間短，整個(gè)檢測60分鐘左右完成。 高通量，一次可以檢測6人份。,29,PDGFR 低表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期和總生存期明顯長于高表達(dá)患者,30,31,化療藥物與檢測靶標(biāo),32,ERCC1表達(dá)與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),ERCC1陰性患者，能從鉑類輔助化療中獲益.,33,BRCA1/2表達(dá)與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),BRCA1過度表達(dá) 鉑類耐藥的預(yù)測因子 抗微管類藥物的敏感因子,34,低TS m

10、RNA水平的腫瘤患者接受氟類化療的效果較好，中位生存期較長。 TS低表達(dá)的患者對培美曲賽的療效好。,TS高表達(dá)影響氟類和培美曲塞藥效,Shirota Y et al. J Clin Oncol. 2001;19:4298-304,35,化療藥物與檢測靶標(biāo),36,小 結(jié),37,NSCLC個(gè)體化用藥系統(tǒng)方案,38,遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC)是由DNA錯(cuò)配修復(fù)基因（MMR)發(fā)生基因突變導(dǎo)致的一種單基因的顯性遺傳疾病，又稱lynch綜合癥，發(fā)生基因異常的個(gè)體其患發(fā)結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)約為60%。,HNPCC實(shí)驗(yàn)室檢測流程,39,1 背景介紹之HNPCC與MMR MSI,目前已發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致人類HNPC

11、C發(fā)生的MMR有MSH2、MLH1、MSH6、PMS1、PMS2，其中MSH2和MLH1基因的功能最重要，其突變占已發(fā)現(xiàn)突變的90%左右。,40,1 背景介紹之HNPCC與MMR MSI,研究顯示， 約有86%-95%的HNPCC具有MSI特征， 而散發(fā)型大腸癌中只有16%。 MSI所產(chǎn)生的遺傳不穩(wěn)定性將加速惡性腫瘤的發(fā)生。 1997年美國NCI (national cancer institution)將MSI確定為檢測和篩選HNPCC的重要方法之一，并推薦將BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S250 5個(gè)位點(diǎn)作為檢測HNPCC的位點(diǎn)。,41,實(shí)驗(yàn)室檢測流程,42,H

12、NPCC檢測項(xiàng)目,43,標(biāo)本要求,44,腫瘤在變,We can look at tumors for changes at the DNA, RNA and protein levels. It certainly gives us a way of looking at what is happening inside a tumor, and thats very exciting. Dr. Gordon Mills Chair Systems Biology MD Anderson Cancer Center Houston, Tx As reported in “The Cancer

13、Test” TIME (June 14, 2007),45,循環(huán)腫瘤細(xì)胞,1869年 Aust Med J，Ashworth最早在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到。 2005年 N Engl J Med，Cristofanilli證實(shí)治療前CTC數(shù)目是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)測因子。,循環(huán)腫瘤細(xì)胞指從實(shí)體瘤中脫離出來并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。,46,獲取CTC需要解決的技術(shù)問題,從紅細(xì)胞和白細(xì)胞中富集惡性腫瘤細(xì)胞 將惡性腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞、白細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等區(qū)分開來,每10mL血液中可能僅含有幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，而10mL血液中含有的白細(xì)胞約有1億個(gè)，紅

14、細(xì)胞有500億個(gè)。,47,三種技術(shù),過濾法,ISET: Isolation by Size of Epithelial Tumor cells 8m孔徑過濾膜，漏檢體積較小的腫瘤細(xì)胞 敏感性低,梯度密度法,腫瘤細(xì)胞和單核細(xì)胞密度小于1.077g/ml CTC純度低，混入較多白細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞會(huì)遷移至血漿層，而聚集后容易下沉 聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)對細(xì)胞有毒性,免疫磁珠法,腫瘤細(xì)胞表面抗原EpCAM與包繞著磁珠的特異性單抗相結(jié)合 CellSearch細(xì)胞保存方法長達(dá)96小時(shí) 實(shí)驗(yàn)室室間差異小 EpCAM的假陽性和假陰性,48,CellSearch 是全球第一也是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于臨床的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）產(chǎn)品,1983 磁流體,49,如何鑒別出CTC?,CTC,Anti-EpCAM磁珠,Anti-CK-PE,Nucleus DAPI,CK,EpCAM,在CellSearch檢測中，CTC 被設(shè)定為： EpCam CK-8,18 和/或19 DAPI CD45,+ + + -,50,