1、1,第九章 分子生物學(xué)研究方法(2),第四節(jié)DNA重組技術(shù),一、目的DNA片段的獲得 二、載體 （質(zhì)粒、噬菌體、cos質(zhì)粒、病毒） 三、DNA酶切 四、DNA的連接和轉(zhuǎn)化 五、重組質(zhì)粒的篩選和鑒定 1. 質(zhì)粒DNA的提取 2. 質(zhì)粒DNA的純化 3. 重組質(zhì)粒的篩選和鑒定,3,DNA重組,DNA重組是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或受體生物進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)一步研究的分子操作的過程。又稱DNA克隆、分子克隆、基因操作。,重組DNA技術(shù)史上的主要事件,1967年第一次發(fā)現(xiàn)DNA連接酶 1970年分離了第一種限制性內(nèi)切核酸酶，發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)

2、錄酶 1972年獲得第一個重組DNA分子 1973年完成第一例細(xì)菌克隆 1975-1977年發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)，1977年完成了全長5387bp噬菌體f174基因組測定 1978年首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素 1981年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因果蠅 1983年獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物 1986年GMO首次在環(huán)境中釋放 1994年第一批基因工程西紅柿在美國上市 2000年完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定(1.2X108bp) 2001年完成第一個人類基因組全序列測定(2.7X109bp) 2005年中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完成水稻基因組全序列測定,5,第一個 DNA

3、 重組子 （Paul Berg, 1972）,EcoRI recognition sites, phage DNA,EcoRI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,6,DNA重組的一般步驟,1. 從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。,2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。,7,3. 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)?/p>

4、受體細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。,4. 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。,重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶,10,生物基因組DNA 細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA 通過機(jī)械切割、核酸限制性內(nèi)切酶消化等處理成適合克隆的DNA小片段 通過PCR技術(shù)可以獲得目的基因 人工化學(xué)直接合成,一、目的DNA片段的獲得,（一）特點(diǎn),基因工程載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞自主復(fù)制的DNA分子。,二、載體,在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)的能力，這樣才能使外源重組的DNA 片段得以擴(kuò)增。 分子量盡可能小，多

5、拷貝、松馳控制型。 能插入較大的外源DNA 片段。 載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標(biāo)記（如抗藥性標(biāo)記基因），以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。 載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點(diǎn)，為避開外源DNA片段中限制酶位點(diǎn)的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點(diǎn)是位于檢測表型的標(biāo)記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng)，則更有利于重組子的篩選。,12,多克隆位點(diǎn),lacZ,載體名稱,載體大小,選擇性標(biāo)記基因,多克隆位點(diǎn)(multiple cloning sites，MCS) 指多個限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。 由許多限制酶切位點(diǎn)組成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DN

6、A序列。,13,（二）類型,從總體上講，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為： 克隆載體，表達(dá)載體，測序載體，穿梭載體等。,DNA 克隆常用的載體有： 質(zhì)粒載體（plasmid），如PBR322、PUC系列、PGEM 系列和pBluescript（簡稱pBS）等； 噬菌體載體（phage）； 柯斯質(zhì)粒載體（cosmid）； 單鏈DNA 噬菌體載體（ssDNA phage ）； 噬粒載體（phagemid）； 酵母人工染色體（YAC）； 細(xì)菌染色體克隆載體（BAC）等。,14,1. 質(zhì)粒載體 是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb 不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA 分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿

7、主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。 作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn): 分子量小，穩(wěn)定存在，較高拷貝數(shù)； 遺傳標(biāo)志； 內(nèi)切酶點(diǎn)。,15,（1）pBR322質(zhì)粒載體,來源于pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）,來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tertr）,來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）,16,（2）pUC質(zhì)粒載體,氨芐青霉素抗性基因(ampr),大腸桿菌-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列,位于lacZ基因中的靠

8、近5-端的一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段，它并不破壞該基因的功能。,來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）,17,（3）pMD19-T質(zhì)粒,18,2. 噬菌體載體,（1）噬菌體的生物學(xué)特性 溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。(烈性噬菌體只具有溶菌生長周期),溶源周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄 主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。 (溫和噬菌體具有溶源生長 周期和溶菌生長周期),19,（2）噬菌體,A. 生物學(xué)特性 組成：蛋白質(zhì)外殼和線狀雙鏈DNA分子組成。

9、DNA長度為48502bp，在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點(diǎn)（cohesive end site）。,20,溫和噬菌體 一般以溶源生長進(jìn)行增殖，脅迫條件下也會進(jìn)入溶菌生長周期。 復(fù)制 溶源周期隨溶源細(xì)菌染色體一起復(fù)制; 溶菌周期的早期是“”復(fù)制，晚期進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制 基因組成 DNA至少包括61個基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分約13為非必須區(qū)段。,21,B. 類型 插入型 （Insertion vect

10、ors） 這種載體僅僅有一個可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。 如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到10kb 置換型 （Replacement vectors） 這種載體具有兩個對應(yīng)的酶切克隆位點(diǎn)，在兩個位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段是噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。 如：Charon 4 載體 克隆能力大，2025kb,22,（3）M13噬茵體,單鏈閉合環(huán)狀噬菌體 只能感染雄性細(xì)菌，外形成絲狀，基因組DNA長約6.4kb，可分為10個區(qū)和507 bp基因間隔區(qū)（IS區(qū)），該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用作單鏈DNA載體的重要前提。,23,復(fù)制與

11、增殖,M13(+)鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部 合成出互補(bǔ)的(-)鏈 DNA, 此雙鏈形式的M13 DNA，稱為復(fù)制型 DNA。 按形式進(jìn)行幾輪復(fù)制之后，基因 的產(chǎn)物便在RF DNA的正鏈特定位點(diǎn)上作切割反應(yīng)，形成一個缺口。 M13基因組利用大腸桿菌的DNA聚合酶I，以環(huán)形的MI3(-)DNA為模板合成 M13(+)DNA。當(dāng)DNA復(fù)制叉沿著模板DNA分子轉(zhuǎn)移到復(fù)制終點(diǎn)時，在基因編碼產(chǎn)物的作用下，新合成的(+)DNA便會被切除下去，并進(jìn)一步環(huán)化形成單位長度的 M13基因組DNA。,24,3、柯斯質(zhì)粒載體,柯斯質(zhì)粒(cosmid)又稱粘粒， “cosmid”一詞是由英文“cos site-carryin

12、g plasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)的質(zhì)粒。所謂柯斯質(zhì)粒其實(shí)是一類由人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，具有與質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為雙鏈、環(huán)狀DNA。,25,柯斯質(zhì)粒具有下列特點(diǎn)： 具有質(zhì)粒載體的特性。 帶有噬菌體的粘性末端(cos區(qū))。 一個或多個酶切位點(diǎn)。 具有高容量的克隆能力。 非重組體粘性質(zhì)粒很小，不能在體外包裝，因而有利于重組體的篩選。,26,4. 病毒載體,組成：（1）病毒復(fù)制和包裝元件 （2）病毒基因 （3）插入的外源基因或元件 （4）病毒外殼/外膜,27,優(yōu)點(diǎn)：（1）利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高； （2）復(fù)雜的裝配

13、過程由細(xì)胞完成； （3）不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)。,常用的病毒載體的特點(diǎn)：,29,根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為、型三大類。 類和類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性。 類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識別位點(diǎn)，且沒有特定的切割位點(diǎn)，酶對其識別位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。 類限制性內(nèi)切酶在識別位點(diǎn)上切割，然后從底物上解離下來。 故類和類酶在基因工程中基本不用。,1. 限制酶的類型,三、DNA酶切,30,型酶,型酶就是通常指的DNA限制性內(nèi)切酶. 它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)

14、生特異的DNA片段； 型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為個堿基對的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序； 型內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生種不同的切口端突出；端突出和平末端。 正是得益于限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)DNA進(jìn)行改造，從而極大地推動了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。,32,同尾酶(Isocaudamer) 能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶，一般是指能產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。具有不同識別序列的限制性內(nèi)切酶,切割DNA分子后產(chǎn)生相同的粘性末端。例如：SalI與XhoI, BamHI與Bgl。 所有平末端酶產(chǎn)生的末端均是相同的，但一般不把它作為同尾酶來研究

15、。,同裂酶(Isoschizomers ) 來源于不同物種但能識別相同DNA序列的限制性內(nèi)切酶，切割位點(diǎn)可以相同也可以不同。比如Sma1和Xma1，它們均識別CCCGGG，但前者切后產(chǎn)生平末端，后者切后產(chǎn)生粘性末端。,33,（一） DNA的連接 1. DNA連接酶 通過合成相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而修復(fù)缺口或催化粘合完全分離的兩個DNA片段。eg: T4 DNA ligase T4 DNA連接酶（需要ATP作為輔助因子）主要用于： （1）連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的片段； （2）雙鏈DNA分子間的平端； （3）在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或 適配子。,四、DNA的連接和轉(zhuǎn)化,

16、34,2. 粘性末端連接,連接后可能出現(xiàn)以下問題： （1）載體自身環(huán)化，造成假陽性背景克隆，為避免此問題，可在連接前，用堿性磷酸酶將載體DNA 5- 端去磷酸化，這樣只有載體和插入片段之間才能發(fā)生連接； （2）插入片段可雙向插入； （3）插入片段可多拷貝插入。,35,3. 平端連接 平端連接的優(yōu)點(diǎn)是可用T4連接酶連接任何DNA平端，這對不同DNA分子的連接十分有利。 平端連接的主要問題是，它的連接效率比粘性末端低，因此需較多的T4 DNA連接酶和較高的底物濃度，聚乙二醇（PEG）可促進(jìn)平端連接反應(yīng)。 4. 人工接頭連接 5. 利用適配子連接,36,（二）重組DNA的轉(zhuǎn)化 1. 轉(zhuǎn)化（trans

17、formation） 指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。接受轉(zhuǎn)化DNA的菌株稱為受體菌株。 轉(zhuǎn)化時，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚恚ㄈ珉姄舴?，CaCl2，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑），使之處于感受態(tài) 即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-，M-)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。,37,常用的大腸桿菌菌株： DH5a JM109 TOP10 常用的農(nóng)桿菌菌株： EHA105 LAB4404,38,（1）將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（

18、0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細(xì)胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。,步驟：,（2）與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。,（3）立即將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會被細(xì)胞所吸收。,（5）涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。,（4）在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)、細(xì)胞活性恢復(fù),40,2. 轉(zhuǎn)染和感染 感染：在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。 轉(zhuǎn)染：在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。,41,五、重組質(zhì)粒的篩選和鑒定,（一）質(zhì)粒DNA

19、的提取,1. 細(xì)菌的收獲 含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基里培養(yǎng) 移至1.5ml離心管 離心沉淀細(xì)胞,2. 細(xì)菌的裂解 （1）堿裂解法 （2）煮沸法,從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選。,42,堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 根據(jù)Birnboim和Doly（1979）以及Ish-Horowicz和Burke（1981）的方法修訂而成的應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法之一。 優(yōu)點(diǎn)：收獲率高，適于多數(shù)的菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作。 基本原理：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅

20、速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒DNA。,十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。,43,純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價(jià)閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費(fèi)時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞

21、克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。,（二）質(zhì)粒DNA的純化,44,氯化銫密度梯度離心法,實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞裂解及DNA分離的過程中，大分子量的細(xì)菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應(yīng)的線性片段，而質(zhì)粒DNA則由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。這種差別對質(zhì)粒DNA的純化是十分有用的。,45,缺點(diǎn),通過氯化銫-EtBr密度梯度離心法雖然可以得到高純度、高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，但它操作復(fù)雜，需要價(jià)格昂貴的氯化銫和超速離心機(jī)設(shè)備，而且溴化乙錠又是一種致癌物質(zhì)，如果操作不慎，不僅會造成環(huán)境污染，還會危及實(shí)驗(yàn)工作人員的身心健康。,46,1. 抗藥性標(biāo)志的篩選 2. 半乳糖苷酶系統(tǒng)篩

22、選 藍(lán)白斑篩選,（三）重組質(zhì)粒的篩選和鑒定,現(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體 (如pUC系列、pBluescript、pGem和它們的衍生載體)都帶有一個大腸桿菌DNA的短片段，其中含有-半乳糖苷酶前146個氨基酸的編碼信息及調(diào)控序列。 在各自獨(dú)立的情況下，pBS(pUC、pGem等)和DH5 a編碼的-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS 和DH5 a融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫-互補(bǔ)。,Lac+細(xì)菌，在生色底物X-gal的存在下被IPTG誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。 帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子

23、由于喪失了-半乳糖苷酶活性，顯白色菌落。,48,3. 菌落快速裂解鑒定法,菌落裂解后去除蛋白，直接凝膠電泳檢測,4. 通過聚合酶鏈反應(yīng)篩選重組子,1 2 3 4 5 6 空白 P,Ds5,基因特異引物,49,5. 內(nèi)切酶圖譜鑒定,6. 菌落或噬菌斑原位雜交,BamH / Pst I,1 2 3 4,制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。 目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段，或目的基因表達(dá)蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸, 或其它物種的同源基因。,50,第五節(jié)基因分離技術(shù),一、克隆的概念 二、克隆基因的分離 1. 應(yīng)用核酸探針 2.

24、應(yīng)用mRNA差別顯示 3. 應(yīng)用cDNA差示分析 4. 應(yīng)用酵母雙雜交體系 5. 基因的圖位克隆法 6. Microarray,(教材p.182-187),51,一、克隆的概念,克隆可以理解為復(fù)制、拷貝，就是從原型中產(chǎn)生出同樣的復(fù)制品，它的外表及遺傳基因與原型完全相同。,分子水平： DNA克隆，也叫分子克隆。含義是將某一特定DNA片斷通過重組DNA技術(shù)插入到一個載體(如質(zhì)粒和病毒等)中，然后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA片斷的“群體”。,細(xì)胞水平：指由同一個祖細(xì)胞（progenitor cell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。,個體水平：指基因型完全相同的兩個或

25、更多的個體組成的一個群體。,如：從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便是屬于同一克隆。,1. 應(yīng)用核酸探針分離克隆目的基因,二、克隆基因的分離,把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進(jìn)行菌落或噬菌班雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆。這個過程叫做克隆基因的分離或篩選。應(yīng)用核酸探針分離目的基因的方法叫做核酸雜交篩選法。此法應(yīng)用廣泛，相當(dāng)有效，尤其適用于大規(guī)模篩選。,54,2. 應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)(DDRT-PCR)分離克隆目的基因,在生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的不同基因按時間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方式

26、，叫做基因的差別表達(dá)（differential expression）。,56,3、應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因,這種方法能夠充分發(fā)揮PCR技術(shù)以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板的性質(zhì)，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法特異性擴(kuò)增目的基因片段。 因?yàn)樵囼?yàn)對象（tester）和供試探針（driver）在接受差示分析前均經(jīng)過一個4堿基切割酶的處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息被擴(kuò)增。每次t減d反應(yīng)后僅設(shè)置72復(fù)性與延伸，94復(fù)性這兩個參數(shù)共20個PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。,57,58,4、應(yīng)用酵母雙雜交體系克隆基因,5、基因的圖位

27、克隆法,59,6、DNA的Microarray,60,Infected IBL,Uninfected IBL,61,第六節(jié)分子雜交技術(shù),一、Southern印跡雜交(DNA) 二、Northern印跡雜交 （RNA） 三、斑點(diǎn)雜交 （dot blotting） 四、Western印跡雜交 （Protein） 五、原位雜交 六、基因芯片 七、酵母雜交技術(shù),62,雜交(hybridization) ：兩條來源不同的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們有大致相同的互補(bǔ)堿基順序，經(jīng)退火處理即可復(fù)性，形成新的雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為核酸的分子雜交。（注意與復(fù)性的區(qū)別） 核酸雜交可以是DNA-DNA，也可

28、以是DNA-RNA雜交。,63,在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。,分子雜交是目前分子生物學(xué)最廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。利用此技術(shù)，可以求出特定基因的頻率、基因組織的特點(diǎn)、基因結(jié)構(gòu)和定位、基因表達(dá)等。,電泳凝膠核酸印跡法,斑點(diǎn)和狹線印跡法,菌落和噬菌斑印跡法,64,E.M. Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的。,材料： 尼龍濾膜 硝酸纖維素濾膜 二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）,步驟：,第一：將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上

29、核酸印跡轉(zhuǎn)移,第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行雜交,一、Southern印跡雜交(DNA),Southern Blotting的過程 1. 堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA 2. 通過電泳液的移動轉(zhuǎn)移膠中的DNA 3. 固定膠中的DNA到膜上 4. 預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測） 5. 結(jié)果檢測,10SSC轉(zhuǎn)移緩沖液,Whatman濾紙,凝膠,Whatman濾紙,紙巾,玻璃板,重物,與探針同源雜交的基因DNA片段,基因組DNA,DNA酶切片段,NC或尼龍膜,NC膜或尼龍膜,67,將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸

30、雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。,二、Northern印跡雜交 （RNA）,68,69,三、斑點(diǎn)雜交 （dot blotting）,70,四、Western印跡雜交 （Protein）,Step 2. Secondary Antibody recognition of primary Ab,Step 3. Color Development,Step 1. Antibody Recognition of target protein/antigen,72,73,組織原位雜交簡稱原位雜交（in situ hybridization），是在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細(xì)胞內(nèi)與RNA或DNA雜交，雜交反應(yīng)

31、在載物片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。,基本步驟是通過適當(dāng)處理使細(xì)胞滲透性增加，探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交、沖洗等。用放射自顯影或免疫酶法或熒光顯示雜交結(jié)果。,五、原位雜交（教材P175）,74,Localization of DNA,Localization of RNA,熒光原位雜交(Florescence In-Situ Hybridization, FISH),一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進(jìn)行檢測的技術(shù)。FISH技術(shù)是將熒光基團(tuán)標(biāo)記特異性的DNA探針，再將標(biāo)記了熒光信號的探針與待測樣本進(jìn)行原位雜交，最后在熒光顯微鏡下對熒光信號進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)。,76,研究DNA分子水平上的多態(tài)性,RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制片段長度多態(tài)性)，是根據(jù)不同品種(個體)基因組的限制性內(nèi)切酶的酶