1、第三章細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),METHODS AND TECHNIQUES,1,本章內(nèi)容提要,第一節(jié) 顯微技術(shù) 第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) 第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù) 第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交,2,第一節(jié) 顯微技術(shù),光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。 電子顯微鏡：以電子束為光源。,3,、光學(xué)顯微鏡,4,1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng) 機(jī)械裝置 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。,（一）普通光學(xué)顯微鏡,5,6,7,3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 R=0.61/NA 其中為入射光線波長(zhǎng)；NA為鏡口率 sin/2，n=介質(zhì)折射率；=鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角

2、） 。,8,表一、幾種介質(zhì)的折射率,9,顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)： 制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。 sin /2的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.050.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。 普通光線的波長(zhǎng)為400700nm，分辨力數(shù)值不會(huì)小于0.2m，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為1000X。,10,（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope,特點(diǎn)：光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡； 有兩個(gè)特殊的濾光片； 照明方式通常為落射式。,11,12,Fluorescenc

3、e image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green,用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。,13,（三）激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。,14,laser confocal scanning microscope, LCSM,15,16,LCSM Image of

4、 a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) /,17,（四）暗視野顯微鏡 dark field microscope,聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。 可觀察 4200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。,18,把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡

5、兩個(gè)特殊之處。 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。 相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。,（五）相差顯微鏡,19,原理,20,用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本,21,（六）偏光顯微鏡polarizing microscope,用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。 光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器 （與起偏器方向垂直的偏振片）。 載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)。,淀粉,22,（七）微分干涉差顯微鏡 Differential interfer

6、ence contrast microscope （DIC）,1952年，Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。,23,（八）倒置顯微鏡 inverse microscope,物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光裝置。,24,（九）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì),采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。 自動(dòng)化與電子化。,25,二、電子顯微鏡,26,1、作用：觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。 （20世紀(jì)60年

7、代） 2、分辨力：為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。,（一）掃描電子顯微鏡,27,Scanning electron microscope（ SEM）,28,3、工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 （為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。),29,掃描電子顯微

8、鏡原理,30,人類紅細(xì)胞,31,酵母,32,人類精子,33,（二）透射電子顯微鏡 transmission electron microscope, TEM,34,以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。 用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），即小于0.2m、光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structures）。,1. 原理,35,36,透射電子顯微鏡,TRAN

9、SMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM,37,表. 不同光線的波長(zhǎng),38,2、制樣技術(shù),1）超薄切片 電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。,39,40,2）負(fù)染技術(shù),用重金屬鹽(如磷鎢酸)對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。,Negative Stained Actin,4

10、1,3）冰凍蝕刻 freeze-etching,亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。,A Yeast Cell,42,（三）掃描隧道顯微鏡scanning tunneling microscope，STM,43,原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率：橫向?yàn)?.10.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。 用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。,44,掃描隧道顯微鏡原理,45,STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu,46,三、顯微操作技術(shù)micromanipulation technique,47,顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切