1、毛細(xì)管電泳的基本原理及應(yīng)用摘要：毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。該技術(shù)可分析的成分小至有機(jī)離子、大至生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等?？捎糜诜治龆喾N體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，比hplc分析高效、快速、微量。關(guān)鍵詞：毛細(xì)管電泳 原理 分離模式 應(yīng)用1概述 毛細(xì)管電泳 (caillary electrophoresis)簡稱 ce，是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流場為驅(qū)動力的新型液相分離分析技術(shù)。ce的歷史可以追溯到 1967年瑞典hjerten最先提出在直徑為3mm的毛細(xì)管中做

2、自由溶液的區(qū)帶電泳(capillary zone electro-phoresis，cze)。但他沒有完全克服傳統(tǒng)電泳的弊端1?，F(xiàn)在所說的毛細(xì)管電泳(ce)是由jorgenson和lukacs在1981年首先提出，他們使用了75mm的毛細(xì)管柱，用熒光檢測器對多種組分實現(xiàn)了分離。1984年terabe將膠束引入毛細(xì)管電泳，開創(chuàng)了毛細(xì)管電泳的重要分支: 膠束電動毛細(xì)管色譜(mekc)。1987年hjerten等把傳統(tǒng)的等電聚焦過程轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行。同年，cohen 發(fā)表了毛細(xì)管凝膠電泳的工作。近年來，將液相色譜的固定相引入毛細(xì)管電泳中，又發(fā)展了電色譜，擴(kuò)大了電泳的應(yīng)用范圍。毛細(xì)管電泳和高效液相色

3、譜（hplc）一樣，同是液相分離技術(shù)，因此在很大程度上hpce與hplc可以互為補(bǔ)充，但是無論從效率、速度、樣品用量和成本來說，毛細(xì)管電泳都顯示了一定的優(yōu)勢毛細(xì)管電泳（c e） 除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點外，其儀器結(jié)構(gòu)也比高效液相色譜（hplc）簡單。 c e只需高壓直流電源、 進(jìn)樣裝置、 毛細(xì)管和檢測器。毛細(xì)管電泳具有分析速度快、分離效率高、試驗成本低、消耗少、操作簡便等特點，因此廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、材料學(xué)以及與化學(xué)有關(guān)的化工、環(huán)保、食品、飲料等各個領(lǐng)域2。2 毛細(xì)管電泳的設(shè)備和基本原理毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)

4、管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法3。毛細(xì)管電泳儀的基本組成如圖1、1 所示 。熔融石英毛細(xì)管的兩端分別浸在含有電解緩沖液的貯液瓶中，毛細(xì)管內(nèi)也充滿同樣的電解緩沖液。在毛細(xì)管接收端之前安裝在線檢測系統(tǒng)。被分析樣品可以從進(jìn)樣系統(tǒng)采用重力法、電遷移法、抽真空法等多種進(jìn)樣方式引入到毛細(xì)管的進(jìn)樣端。當(dāng)樣品被引入后,便開始在毛細(xì)管兩端施加電壓 。樣品溶液中溶質(zhì)的帶電組分在電場的作用下根據(jù)各自的荷質(zhì)比向檢測系統(tǒng)方向定向遷移。ce中的毛細(xì)管目前大多是石英材料。當(dāng)石英毛細(xì)管中充入 ph值大于 3的電解質(zhì)溶液時 ,管壁的硅羥基(- sio

5、h)便部分解離成硅羥基負(fù)離子(- sio-) ,使管壁帶負(fù)電荷。在靜電引力下 ,- sio-會把電解質(zhì)溶液中的陽離子吸引到管壁附近，并在一定距離內(nèi)形成陽離子相對過剩的擴(kuò)散雙電層 (見圖 24)。在外電場作用下 ,上述陽離子會向陰極移動。由于這些陽離子實際上是溶劑化的(水化的)，它們將帶著毛細(xì)管中的液體一起向陰極移動，這就是 ce中的電滲流(eof)。電滲流的強(qiáng)度很高，以致于所有進(jìn)入毛細(xì)管中的樣品，不管是陰離子、陽離子或中性分子，都會隨著液體向陰極移動。因待測樣品中正離子的電泳方向與電滲流方向一致，故最先到達(dá)毛細(xì)管的陰極端;中性粒子的電泳速度為零 ,遷移速度與電滲流速度相當(dāng)；而負(fù)離子的電泳方向則

6、與電滲流方向相反，但因電滲流速度約等于一般離子電泳速度的 57倍5，故負(fù)離子也將在中性粒子之后到達(dá)毛細(xì)管的陰極端。由于各種粒子在毛細(xì)管內(nèi)的遷移速度不一致，因而使各種粒子在毛細(xì)管內(nèi)能夠達(dá)到很好的分離。3 毛細(xì)管電泳的分離模式根據(jù)分離原理不同，ce分離基本模式有6種，如表 1 所示。 表 1 毛細(xì)管電泳的分離模式和應(yīng)用tab. 1 separation modes and application of ce以上各模式以毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、膠束電動毛細(xì)管色譜這3種應(yīng)用較多。4 毛細(xì)管電泳的應(yīng)用4.1 ce在藥物成分分析中的應(yīng)用目前，ce在天然中草藥分析領(lǐng)域中的應(yīng)用主要集中在生物堿和黃酮及

7、其甙類方面、蒽醌類分析也有報道。生物堿有類似于堿的性質(zhì)，在ph 11），使糖基上的羥基去質(zhì)子而帶負(fù)電荷， 直接進(jìn)行電泳分離，用紫外（195nm）檢測。也可以選用硼酸鹽緩沖液，硼酸鹽與糖基絡(luò)合形成帶負(fù)電荷的絡(luò)合物以進(jìn)行電泳分離，用紫外檢測。簡單單糖的分析方法也適于簡單寡糖的分析12。多糖一般利用酸解或酶解的方法將其轉(zhuǎn)化為寡糖后進(jìn)行分析。糖蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后生成糖肽，糖肽的圖譜被認(rèn)為是糖蛋白的指紋圖譜。糖肽的分離主要是基于其pka值的不同而進(jìn)行ce分離，并不是基于糖鏈結(jié)構(gòu)的不同， 因此所選用的緩沖液的組成及其ph的選擇尤為重要，其檢測也是基于蛋白質(zhì)的檢測。糖脂既可以直接用ce分離，也可以用神經(jīng)酰胺

8、聚糖酶將糖鏈釋放出來后進(jìn)行分析。糖胺聚糖（gag）類糖基的聚糖部分有透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和肝素等，一般都含有重復(fù)的二糖單元，而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖，這些寡糖既帶電荷又有紫外吸收（232nm），因此很適合用ce進(jìn)行分析。另外，ce在糖型分析方面也取得了較大的成功。在糖的檢測方面，紫外分析是最早用于ce進(jìn)行糖類檢測的，但它的靈敏度相對不高，檢出限一般只有106mol數(shù)量級。利用激光誘導(dǎo)熒光檢測對糖類進(jìn)行柱前高效熒光標(biāo)記，可使檢出限達(dá)到10-9mol水平。在改進(jìn)檢測系統(tǒng)的同時，中性糖類的極性標(biāo)記也在不斷改進(jìn)與完善。其中一種極性標(biāo)記物為8-氨基-萘-1，3，6-三磺酸，利用其

9、可以快速高效地對均一寡糖和復(fù)雜多糖進(jìn)行分離分析， 具有很高的分辨率。4.5ce在臨床化學(xué)上的應(yīng)用ce 在臨床化學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛, 所檢測樣品的來源可分為尿樣、血漿血清、腦脊液、紅細(xì)胞、其它體液或組織以及實驗動物活體(invivo)試驗。被分析的組分則包括肽類、各種蛋白、病毒、酶、糖類、寡核苷酸、dna、小的生物活性分子、離子、藥物及其代謝產(chǎn)物。具體應(yīng)用可分為: 臨床疾病診斷 臨床蛋白分析、 臨床藥物監(jiān)測、代謝研究、病理研究、同工酶分析、聚合酶鏈反應(yīng)(pcr )產(chǎn)物分析、dna 片斷及序列分析等。所應(yīng)用的ce 模式包括cze、mecc、cge、 citp 和毛細(xì)管等電聚焦(cief)13.14

10、。4.6ce用于檢測非均一性(多樣性, heterogeneity)許多純化蛋白, 甚至在它們的天然狀態(tài), 往往都不是單一分子片斷, 而是由相關(guān)分子組成, 稱為非均一性(多樣性)。產(chǎn)生多樣性的原因有: 氨基酸(aa )的序列不同, 如突變體的某位置aa 改變或aa 側(cè)鏈改變; 后轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生不同長度的多肽鏈; 糖蛋白不同程度的糖基化, 如存在不同數(shù)量的寡糖鏈, 寡糖鏈有不同的單糖組成、 序列及單糖之間的異構(gòu)連接。 采用cze, mecc, cief, ce-ms 可檢測這些非均一性。用于心臟病的重組人組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(rtpa )含 4 個可能糖基。yim 15用 cze 和cief 研

11、究了制備過程中 rtpa 不同糖基化程度引起的非均一性, 結(jié)果表明, cief方法要比cze的好。還有用cze 對人促紅細(xì)胞生成素( rhuepo )16、用mecc對重組人c2干擾素(ifn2c)17及ce-ms18研究蛋白的多樣性。有關(guān)蛋白的非均一性在臨床中的一些應(yīng)用, 如人鐵傳遞蛋白、血清蛋白的變異、異構(gòu)酶的分析等。4. 7 ce用于農(nóng)藥殘留量的分析對農(nóng)藥殘留物的測定國外研究的較多。lazer等19將飛行時間質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳儀聯(lián)用，采用樣品堆積技術(shù)進(jìn)樣對 paraquat 和 diquat 兩種除草劑進(jìn)行了分離，檢測限低至 10- 17mol/l。farran等20采用(乙腈) = 50

12、 %的磷酸-硼砂緩沖液分離出兩種苯氧羧酸類除草劑。hinsmann 等21通過自動在線濃縮樣品， 采用固相微柱以十二烷基硫酸鈉(sds)作膠束 ,添加少量乙腈 ,在13min內(nèi)分離測定了水中的7種不同種類的農(nóng)藥?；酋ｋ孱惢衔锸且活愊鄬^新的除草劑 ，因此這一類化合物在水和食品中的殘留量的測定十分重要。lipez avila等22采用3mods硅膠填充柱來分離這一類化合物 ,線性范圍為1100mg/l。mayer等報道了農(nóng)藥cinosulfuron 及其副產(chǎn)物的毛細(xì)管電色譜的分離分析。游靜等23對毛細(xì)管電泳在農(nóng)藥手性拆分的進(jìn)展做了綜述。4.8 ce用于純度檢測ce在國外分子生物學(xué)實驗室及生物工

13、程藥廠里已廣泛用作最有效的純度檢測手段。當(dāng)?shù)鞍椎氖杷韵嘟鼤r, 它們在hplc 柱中往往同時流出, 因此在對蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究(包括n 端序列和肽譜)之前, 必須監(jiān)測從hplc 所得肽片斷的純度?？焖賑e 純度檢測可節(jié)約樣品和節(jié)省序列測定所需時間。因ce 和rp2 hplc 分離機(jī)理不同, 所以當(dāng)用ce 檢查由rp2hplc 純化制得的某一合成肽(一個峰, 純度為 99.12% )時, 發(fā)現(xiàn)分出 6 個組分, 主峰純度僅為50%。或許這就是部分基因工程產(chǎn)品用hplc 檢測純度很高而實際生物活性卻各批差異很大的一個原因。至于用ce 對藥廠生產(chǎn)及qc 作純度檢測的應(yīng)用實例比比皆是, 如對胰島素、白細(xì)胞介素、人生長激素、粒性巨噬細(xì)胞菌落刺激因子(用cief )等的檢測。純度檢測時用ce 可檢測出多肽鏈上單個氨基酸的差異。ce 用于純度檢測可用cze,mecc, sds2 cge, cief 多種模式。還有文獻(xiàn)討論了用不同方法(包括rp2 hplc, iec2 hplc, sds2pa ge 及ce)進(jìn)行純度檢測的最有效的策略24。5 結(jié) 論作為一種蛋白質(zhì)、多肽、