1、實(shí)驗(yàn)二,馬 立 克 氏 病瓊 脂 擴(kuò) 散 實(shí) 驗(yàn),雞馬立克氏病是由 雞馬立克氏病病毒 （MDV）引起的雞的一種 腫瘤性傳染病。臨床上以 消瘦、麻痹、皮膚和內(nèi)臟 出現(xiàn)腫瘤為主要特征?？?造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是 世界養(yǎng)雞業(yè)的主要疾 病之一。,雞馬立克氏病引起的劈叉姿勢(shì),流行病學(xué) 臨床癥狀 病理組織學(xué)檢查 病毒分離鑒定 血清學(xué)試驗(yàn): 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(OIE推薦的替代試驗(yàn)方法),馬立克氏病診斷主要根據(jù), 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),AGP可用于20日齡以上馬立克氏病雞羽髓抗原檢測(cè)和1月齡以上雞血清抗體檢測(cè)。,目的要求 了解瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行疾病診斷的操作和結(jié)果判定方法 儀器與材料 器材：瓊脂打孔器、微量移液器或帶膠

2、乳頭滴管、平皿等。 試劑：馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。 實(shí)驗(yàn)類型 單向單擴(kuò)散、單向雙擴(kuò)散、雙向單擴(kuò)散、雙向雙擴(kuò)散,實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊蟆㈩愋?、儀器與材料,利用可溶性抗原和抗體在半固體凝膠中進(jìn)行相向擴(kuò)散反應(yīng)，當(dāng)抗原抗體分子相遇并達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，就會(huì)互相結(jié)合、凝集，在兩孔之間比例最合適的位置上出現(xiàn)白色沉淀帶，從而判定相應(yīng)的抗體和抗原。 可用于20日齡以上馬立克氏病雞羽髓抗原檢測(cè)和1月齡以上雞血清抗體檢測(cè)。,實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)原理,瓊脂糖的疏散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于大分子的自由遷移； 合適比例的抗原抗體結(jié)合后聚集形成沉淀； 沉淀的產(chǎn)生阻止抗原抗體復(fù)合物的自由運(yùn)動(dòng)； 沉淀帶一經(jīng)形成，就像一道特異性的屏

3、障一樣，繼續(xù)擴(kuò)散而來(lái)的相同的抗原抗體，只能是沉淀帶加濃加厚，而不能再向外擴(kuò)散，但對(duì)其他抗原抗體系統(tǒng)則無(wú)屏障作用。,沉淀線的特征與位置： 1 抗原、抗體的特異性和濃度 2 抗原、抗體分子的大小 3 擴(kuò)散率,實(shí)驗(yàn)原理,a.如抗原抗體的濃度基本平衡時(shí)，此沉淀帶的位置主要決定 于兩者的擴(kuò)散系數(shù)。 b.如果抗原過(guò)多，則沉淀帶向抗體偏移，反之亦然。,實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)原理,c.,1%瓊脂粉,0.01M PBS,封底,1萬(wàn)硫柳汞,水浴加熱融化,瓊脂平板制備,雞群馬立克氏病感染情況的監(jiān)測(cè)通常采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)， 檢測(cè)對(duì)象包括：血清中馬立克氏病病毒特異抗體或感染雞羽髓 中馬立克氏病病毒抗原。其操作方法如下： 1瓊脂糖

4、平板制備 用0.01M pH7.4的PBS配制1瓊脂糖溶 液，水浴加溫充分溶化后，加入培養(yǎng)皿，制成厚度約23mm厚 的瓊脂糖凝膠板；置于室溫下冷卻凝固后，用7孔（梅花孔）打 孔器準(zhǔn)確打孔，加熱封底。,實(shí)驗(yàn)步驟,2檢測(cè)血清抗體時(shí)，中央孔內(nèi)滴加馬立克氏病病毒標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，周邊孔滴加待檢血清，但至少一孔加陽(yáng)性血清，抗原和血清的加入量以加滿而不溢出為度。樣品加畢后，將瓊脂平皿加蓋后平放于加蓋的濕盒內(nèi)，37溫箱中孵育824h，觀察并記錄結(jié)果。測(cè)定抗體效價(jià)時(shí)可倍比稀釋血清，以出現(xiàn)沉淀帶的血清最大稀釋度為抗體效價(jià)。,實(shí)驗(yàn)步驟,3檢測(cè)抗原時(shí)，中央孔加馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，周邊1、4孔加馬立克氏病標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原

5、，周邊2、3、5、6孔加待檢羽髓浸液，即在試管內(nèi)加入12滴PBS然后將羽髓在其中擠壓而成。加樣后將瓊脂平皿置濕盒內(nèi)，于37溫箱孵育，824h內(nèi)觀察結(jié)果。,實(shí)驗(yàn)步驟,1、切勿劇烈振蕩融化后的瓊脂糖，防止氣泡的出現(xiàn)。 2、反應(yīng)時(shí)間要適宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，沉淀線可解離而導(dǎo)致假 陰性、不出現(xiàn)或不清楚。 3、加樣時(shí)，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。 4、每加完不同的樣后要更換槍頭，以免造成污染。,注意事項(xiàng),抗原檢測(cè),檢測(cè)羽髓抗原,2，3，5，6孔分別 加入倍比稀釋的待檢羽髓浸液,檢測(cè)待檢血清,15孔分別加入倍比稀釋的待測(cè)效價(jià)的血清，6孔加PBS,抗體檢測(cè),當(dāng)被檢樣品孔與中心孔之間形成清晰的沉淀線，并與周邊已知抗原孔的沉淀線互相融合時(shí)判為陽(yáng)性；不出現(xiàn)沉淀線者判為陰性,結(jié)果判定,已知抗原與陽(yáng)性血清之間所產(chǎn)生的沉淀線末端彎向被檢樣品孔內(nèi)側(cè)時(shí)，則該被檢樣品判為弱陽(yáng)性。,結(jié)果判定,Ag+,Ab+,待檢血清,被檢材料可能出現(xiàn)兩條以上沉淀線，其中一條與已知抗原和陽(yáng)性血清的沉淀線融合者判為陽(yáng)性。當(dāng)抗原存在多種成分時(shí)，將呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應(yīng)線，因此可用來(lái)檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度，比較抗原之間的異