1、不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案,北京百泰克生物技術(shù)有限公司（北京市海淀區(qū)上地信息路15號）,FaxTel廣州代理商：廣州弗爾博生物科技有限公司 E-mail: focusbio_,不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案,-核酸提取攻略,北京百泰克生物技術(shù)有限公司（北京市海淀區(qū)上地信息路15號）,不同樣品RNA提取最適方法 RNA純度與質(zhì)量考察 RNA提取常見問題及解決方案 常見樣品DNA提取 特殊樣品DNA提取 DNA分離純化中常見問題分析,內(nèi)容概要,樣品,裂解液,上層溶液,液氮研磨 或其他方法處理,抽提,

2、細胞裂解,干燥溶解 或洗脫,離心洗滌,酒精沉淀 或介質(zhì)吸附,RNA提取流程,沉淀法：異丙醇或乙醇 介質(zhì)吸附法：,RNA提取常用方法-沉淀方法,異硫氰酸胍/苯酚法 在變性劑異硫氰酸胍的作用下，細胞被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放； 釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離； 有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。,RNA提取常用方法-裂解方式,胍鹽 /-巰基乙醇 鹽酸胍裂解樣本 ，抑制 RNase 的活性 ； -巰基乙醇變性蛋白,BioTeke的RNA提取試劑具有明顯的優(yōu)勢,在經(jīng)典試劑的基礎(chǔ)上，不斷升級。 多款高品質(zhì)的RNA提取

3、試劑： Tri pure （Trizol） RNApure（Trizol法的升級產(chǎn)品）,組織/細胞樣品RNA提取,材料： 小鼠肝臟組織,方法： BioTeke RNApure高純總RNA 快速提取試劑盒 0.1g樣品組織 結(jié)果：,圖：小鼠肝臟組織RNA,1 2 3 4,RNApure 高純總RNA快速提取試劑,1 2 3,圖片說明： 1 BioTeke RNAclean 2 BioTeke TRIpure (TRIzol法) 3 BioTeke RNApure 離心柱型 (注：本圖實驗材料為植物葉片）,同一樣品基因組DNA和RNA分提,原理： 根據(jù)基因組DNA和RNA在硅基質(zhì)膜上的結(jié)合條件不同

4、，用兩根離心吸附柱分別提取基因組DNA和RNA。,特殊樣品RNA提取-血液,圖1全血樣品溶解在TRI pure LS Reagent試劑后的狀態(tài),圖2泳道1與2，在-80度保存一個月后的提取結(jié)果。M泳道：標(biāo)準(zhǔn)的Hela細胞RNA,材料： 松針、冬青、香蕉、木菠蘿和楊樹,方法： 通用植物總RNA提取試劑盒 （離心柱型） 0.1g樣品組織 結(jié)果： 得率：約35-40g 純度：OD260/OD2801.82-1.95,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,圖片說明：1、2 楊樹；3、4 香蕉；5、6 松針；7、8 冬青；9 、10 木菠蘿,多糖多酚植物樣品RNA的提取,1 2 3 4 5 6 7

5、 8 9 10,試劑盒適用范圍： 水稻種子、小麥種子、玉米種子、高粱種子、擬南芥種子、大豆種子、蘋果、葡萄、香蕉、棉花、龍眼、荔枝、各種草坪牧草植物、各種樹木、各種花卉等絕大多數(shù)植物,圖片說明：1、2DNA和大RNA；3、4Micro RNA (材料為小鼠肝臟組織),Micro RNA提取,1 2 3 4,提取原理： 傳統(tǒng)方法：先提取總RNA然后跑膠回收或沉淀Micro RNA。 新方法：通過裂解液裂解和酸酚分層后過柱兩次，一次去除基因組DNA和大片段RNA，后一次吸附Micro RNA，然后漂洗收集。,新方法特點： 高效分離小RNA，同時分離總RNA 可用于miRNA、siRNA和snRNA

6、的分析 適用各種來源的樣品 提取時間短，約30分鐘完成實驗,生物大分子具有共軛雙鍵，在260和280nm波長處有光吸收峰。 純度：紫外分光光度計測定所提總RNA在260nm和280nm波長處的光吸收，以A260/A280的比值來判斷總RNA的純度。 質(zhì)量：甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定。,RNA純度與質(zhì)量考察,RNA提取常見問題及解決方案,RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 電泳帶型異常 下游實驗效果不佳,RNA的降解,新鮮細胞或組織： 裂解液的質(zhì)量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 組織裂解不充分 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟，胸腺等)，很難避免 RNA 的降解。 建

7、議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。,RNA的降解,冷凍樣品： 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70冰箱保存。樣品要相對小一點； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，研磨過程中及時補充液氮。,RNA的保護,采集樣品的保護： 通常用液氮保存 樣品保護劑RNAfixer,樣品浸泡其中可以在37保存一天，25一周，4一個月，-20一年左右。,環(huán)境中RNase的清除： DEPC處理各種實驗器具 RNAsafe對溶液中RNase進行清除。 RNA酶噴霧清除劑，可對固體表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染

8、。,蛋白質(zhì)污染： 不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。 減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底 解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚殘留： 不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。 解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,OD260 /OD280 比值偏低,OD260 /OD280 比值偏低,抽提試劑殘留： 確保洗滌時要徹底懸浮 RNA，并且徹底去掉 75% 乙醇。 解決辦法:再沉淀一次后，溶解。 設(shè)備限制： 測定OD260 及OD280 數(shù)值時，要使OD260 讀數(shù)在 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性

9、最好。 用水稀釋樣品： 測 OD 時，對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。,非變性電泳： 上樣量超過 3g，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致 28S 和 18S 條帶分不開。 變性電泳條帶變淡： EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些； 甲醛的質(zhì)量不高 。,電泳條帶異常,抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,下游實驗效果不佳（RNA降解）,不同樣品基因組DNA提取,常見樣品基

10、因組DNA提取 細胞/組織/細菌/血液基因DNA提取 植物材料DNA提取 特殊樣品基因組DNA提取 大量血液樣品DNA提取 環(huán)境微生物DNA提取 臨床樣本DNA提取 DNA分離純化中的常見問題分析,基因組DNA提取流程,化學(xué)方法 CTAB法：適用于植物材料等。是一種陽離子去污劑，溶解細胞膜，與核酸結(jié)合。在高鹽下溶解釋放DNA。 SDS法：適用于血液，細胞，動物組織，細菌，酵母等 物理方法 機械剪切，超聲波破碎，研磨勻漿等。易造成DNA斷裂。 酶法 蛋白酶K BioTeke基因組DNA提取系列試劑盒綜合利用上述方法,基因組DNA提取流程-細胞裂解,特點： 不需要使用有毒的氯仿、苯酚等試劑 多次柱

11、漂洗確保高純度；長度可達30-50Kb,提取原理：,組織/細胞/細菌/血液基因組DNA提取,玉米葉片基因組DNA提取 （使用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒）,提取原理：,植物材料基因組DNA提取,特殊樣品基因組DNA提取,傳統(tǒng)方法適用于所有材料基因組DNA的提??？ 比如大量血液？ 比如土壤/糞便中的微生物基因組DNA的提??？ 比如病毒及其他微量樣品DNA的提??？ NO！,中量/大量血液基因組DNA提取,傳統(tǒng)方法 消化后，用酚/氯仿抽提， 時間長，損害操作人員健康 BioTeke創(chuàng)新 不用蛋白酶消化 不用酚/氯仿抽提 結(jié)果： 得率：約75-250g /5mL血樣 純度：OD260/OD280

12、1.87-1.95,5ml全血基因組DNA提取電泳結(jié)果,土壤/糞便微生物基因組DNA提取,其他品牌試劑盒存在缺點： 采用玻璃珠或鋼珠破碎，導(dǎo)致基因組斷裂嚴(yán)重； 必須購買破碎專用設(shè)備，增加使用成本； 采用包括玻璃奶、離心吸附柱串聯(lián)的純化方式，導(dǎo)致DNA大量損失，得率很低，很難真實反映土壤微生物的多樣性。 BioTeke的技術(shù)創(chuàng)新： 采用酶法破碎，保證基因組的完整性； 用異丙醇沉淀DNA，DNA無損失。,臨床樣品基因組DNA提取,病毒基因組DNA提取 酵母基因組DNA提取 口腔拭子DNA提取 微量樣品DNA提取 石蠟組織DNA提取 頭發(fā)DNA提取,一步法DNA提取擴增,原理： 綜合微量樣品基因組D

13、NA提取和高效的PCR擴增試劑。從毛發(fā)、石蠟組織等微量組織中高效提取足夠濃度的DNA，然后進行PCR擴增。操作簡單、方便，可對大量樣品同時進行操作。,保證基因組DNA的完整性和純度 提高DNA的洗脫效率 DNA的儲存,基因組DNA分離純化中的注意事項,保證基因組DNA的完整性和純度 提高DNA的洗脫效率 DNA的儲存,基因組DNA分離純化中的注意事項,簡化操作步驟，縮短操作時間 減少物理因素對DNA的降解，震蕩、攪拌等 減少化學(xué)物質(zhì)對DNA的降解，操作多在pH4-10 防止基因組DNA的生物降解：DNase,保證基因組DNA的完整性和純度 提高DNA的洗脫效率 DNA的儲存,基因組DNA分離純

14、化中的注意事項,洗脫液65度預(yù)熱10分鐘 洗脫體積不小于30L 洗脫2次或者3次,保證基因組DNA的完整性和純度 提高DNA的洗脫效率 DNA的儲存,基因組DNA分離純化中的注意事項,可長期儲存于pH=7.0的ddH2O或TE 不易制成干品儲存 分裝低溫保存,如何提高微量核酸提取或回收后的濃度,核酸助沉劑的應(yīng)用 微量吸附柱的應(yīng)用-15l洗脫體系 質(zhì)粒提取 膠回收或PCR產(chǎn)物回收 微量細胞/組織DNA/RNA提取 病毒DNA/RNA提取 微量臨床樣本DNA/RNA提取,不同樣品核酸提取、擴增、熒光定量PCR完美解決方案,-Real-time qPCR攻略,北京百泰克生物技術(shù)有限公司（北京市海淀區(qū)

15、上地信息路15號）,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及應(yīng)用 Real-time qPCR成功關(guān)鍵 Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析 Real-time qPCR常見問題及解決方案,主要內(nèi)容,中心法則與RT、PCR,RNA,DNA,RT,PCR,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。 提取RNA的質(zhì)量會影響到RT的產(chǎn)量及cDNA的完整性。 整個過程要求無RNA酶操作。 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑都會對產(chǎn)物的質(zhì)量造成一定的影響。,反轉(zhuǎn)錄相關(guān)因素,Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 高效的逆轉(zhuǎn)錄活性，且無RNaseH活性 Thermo M-ML

16、V反轉(zhuǎn)錄酶 高效的逆轉(zhuǎn)錄活性，且無RNaseH活性 適合合成長片段的cDNA,有很強的模板兼容性，對高GC含量（75%以上）和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的模板效果顯著 在42-60具有較好的熱穩(wěn)定性。,One step RT-PCR,模板： 使用BioTeke公司的RNApure 總RNA提取試劑盒提取的雞肝臟組織RNA,目的片段：管家基因-Actin 反應(yīng)體系： 反應(yīng)程序：,RT-PCR相關(guān)產(chǎn)品,Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，10000u/198元 Super RT Kit cDNA 第一鏈合成試劑盒50次，特價490元 Super One-step RT-PCR Kit 一步法RT-PCR試劑盒50次，特

17、價880元 Thermo 系列產(chǎn)品買二贈一！ Thermo M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，10000u/580元 Thermo RT Kit cDNA 第一鏈合成試劑盒50次，價格1200元 Thermo One-step RT-PCR Kit 一步法RT-PCR試劑盒50次，價格1400元,反轉(zhuǎn)錄酶及試劑盒系列產(chǎn)品講座期間特價優(yōu)惠！,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及應(yīng)用 Real-time qPCR成功關(guān)鍵 Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析 Real-time qPCR常見問題及解決方案,實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用,基因表達差異分析 拷貝數(shù)分析 SNP檢測 miRNA定量 轉(zhuǎn)

18、基因成分定量分析 臨床診斷、疾病及藥物研發(fā)等,Real-time qPCR原理,如何對初始模板定量 熒光信號如何產(chǎn)生？,Real-Time qPCR主要概念,Real-Time qPCR曲線的意義,擴增曲線,熔解曲線,圖片為：首都醫(yī)科大學(xué)演示實驗結(jié)果 材料：小鼠肝臟 基因：-actin,實時熒光定量 PCR 的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種。 非探針類則是利用熒光染料（如SYBR Green I）或者特殊設(shè)計的引物(如LUX Primers)來指示擴增的增加。 探針類(TaqMan探針和 分子信標(biāo))是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加。 后者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，

19、但前者則簡便易行。,熒光染料和熒光探針,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR GreenI的最大吸收波長約為497nm ，發(fā)射波長最大約為520nm。 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。,LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標(biāo)記的引物實現(xiàn)定量

20、的一項新技術(shù)。目標(biāo)特異的引物對中的一個引物 3 端用熒光報告基團標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標(biāo)片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號。,LUX 引物工作原理,TaqMan探針工作原理,F,Primer,Primer,Degradation of TaqMan probe by DNA polymerase,Reporter,Quencher,Suppression of fluorescence,分子信標(biāo)（molecular beacon）工作原理,分子信標(biāo)：一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾

21、結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。 分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細的設(shè)計，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)的構(gòu)象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子（圖5）。,熒光閾值(Threshold),Ct,Ct值是擴增DNA的量達到閾值時候的循環(huán)次數(shù)。,Ct 值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的

22、對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， Ct值越小。 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表 Ct 值（如圖所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,Ct值,Real-time qPCR流程,一步法和兩步法優(yōu)缺點比較,根據(jù)自己需求，選擇合適的方法！,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及應(yīng)用 Real-time qPCR成功關(guān)鍵 Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析 Real-time qPCR常見問題及解決方案,Real-time qPCR成功因素,引物設(shè)計： 3末端盡量不是A； 1824b

23、p；擴增產(chǎn)物80-150bp; 設(shè)計在基因保守區(qū)內(nèi) Taqman探針：盡量靠在上游引物；長度3045bp，Tm比引物高至少 5；5端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量 RNA質(zhì)量和定量 比較好，2條主帶可見（28s和18s）；定量準(zhǔn)確 內(nèi)標(biāo)（housekeeping gene）正確選擇 18s rRNA, -actin, GAPDH等 標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確制作R20.99,反應(yīng)體系： 模板濃度不要太高，反轉(zhuǎn)錄最多1g總RNA， PCR一般1L反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； 引物濃度一般100nM-1mM； 根據(jù)kit要摸索最佳反應(yīng)條件 小心操作： 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣，即使是混 合液！每個

24、樣品至少要做3個平行孔。每組實驗最好有3個重復(fù)，做統(tǒng)計 分析。,Real-time qPCR成功因素,做real-time qRT-PCR前，做個普通的PCR，檢測您的反應(yīng)條件！,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及應(yīng)用 Real-time qPCR成功關(guān)鍵 Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析 Real-time qPCR常見問題及解決方案,Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析,基線（baseline） 通常是315個循環(huán)的熒光信號 同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線 閾值（threshold) 自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 手動設(shè)置：置于指數(shù)擴

25、增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。 同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值， 但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。 Ct值 :與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系 分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。,統(tǒng)計分析方法,絕對定量： 此方法是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的質(zhì)粒DNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。 相對定量： 通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,一般是 2-Ct ?；蛘呤强紤]擴增效率的Pfaffl法。,絕對定量

26、,相對定量,實時檢測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測 敏感性高 需要樣品少 特異性高（Taqman） 精確定量,Real-time qRT-PCR優(yōu)點,RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及應(yīng)用 Real-time qPCR成功關(guān)鍵 Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析 Real-time qPCR常見問題及解決方案,特異性 重復(fù)性 靈敏度 其他問題,常見問題討論,擴增的特異性,引物？,Tm，重新設(shè)計引物，優(yōu)化條件,Tm,重復(fù)性-判斷實驗優(yōu)劣的重要指標(biāo),判斷指標(biāo)：主要為標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV） 影響重復(fù)性的因素： PCR 反應(yīng)擴增的效率：優(yōu)化實驗條件，使反應(yīng)體系達到最佳擴

27、增效率 。 目的基因的初始濃度： 使用初始濃度具有較高數(shù)量級的樣本或作平行孔。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響：不少于5個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍；理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性，質(zhì)粒DNA 或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA。,影響靈敏度的因素,反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響 可以用水解探針代替SYBR Green I，有文獻報導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。 可以使用熱啟動辦法或使用特殊處理的Taq酶 要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計 如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當(dāng)將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增。 注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合

28、后立即開始進行擴增。 循環(huán)數(shù) Mg2的濃度,Q1:無Ct值（信號）出現(xiàn),可能性不大,檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。 引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。 模板量不足: 對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。,Q2:Ct值出現(xiàn)過晚（Ct38）,擴增效率低: 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。 PCR產(chǎn)物太長: 一般采用80-150bp的產(chǎn)

29、物長度。,Q3:標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳,加樣存在誤差: 使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。 標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解: 應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。 引物或探針不佳: 重新設(shè)計更好的引物和探針 模板中存在抑制物，或模板濃度過高。,Q4:陰性對照也出現(xiàn)明顯的起飛,反應(yīng)mix或水被污染。 引物二聚體的出現(xiàn)： 用SG法在35cycles以后陰性出現(xiàn)起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。 反應(yīng)過程中探針的降解：用PAGE電泳對探針進行檢測。 ROX校正的問題：如果使用了，則可能是ROX的降解所造成。,Q5:熔解曲線不止一個主峰,引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。 模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。,Q6:擴增效率低,反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 反應(yīng)條件不夠優(yōu)