1、第四章 薄 層 色 譜,TLC是一種簡單、快速的色譜技術(shù)。TLC法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化的物質(zhì)的分離。 薄層色譜不需要特殊設(shè)備，操作簡單，試樣和展開劑用量少，展開速度快。 TLC經(jīng)常被用于探索柱色譜分離條件和監(jiān)測(cè)柱色譜過程 。 在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，可利用薄層色譜觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失來判斷反應(yīng)是否完成。,4.1 概 述 一、發(fā)展歷史 1938年俄國人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。 1965年德國化學(xué)家出版了“薄層色譜法”一書，促進(jìn)了這一技術(shù)的發(fā)展。 因TLC法設(shè)備簡單，分析速度快，分離效率高，結(jié)果直觀，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期發(fā)展了高效薄層色

2、譜。80年代以后發(fā)展了薄層色譜光密度掃描儀，各步操作實(shí)現(xiàn)了儀器化，并實(shí)現(xiàn)了計(jì)算機(jī)化。,二、特點(diǎn):（薄層色譜與高效液相色譜的差別） 1.固定相和流動(dòng)相 TLC流動(dòng)相流動(dòng)靠毛細(xì)作用力，流動(dòng)相選擇較少受限制，固定相不用再生。 HPLC是在封閉的系統(tǒng)內(nèi)，流動(dòng)相流量靠泵控制，溶劑選擇受檢測(cè)器限制，固定相需再生。 2.樣品處理 TLC要求沒有HPLC嚴(yán)格。,3.色譜分離 TLC可同時(shí)分離多個(gè)樣品，并可采用相同或不同溶劑進(jìn)行同向或雙向多次展開，通常采用正相色譜，色譜后衍生化方便。 HPLC一次只能分離一個(gè)樣品，通常采用反相色譜，色譜后衍生化受限制。 4.對(duì)污染物抗受力 TLC顆粒物質(zhì)、腐蝕性物質(zhì)、不可逆吸附

3、物質(zhì)均無影響。 HPLC 顆粒物質(zhì)、腐蝕性物質(zhì)、不可逆吸附物質(zhì)均有大的影響。,4.2 薄層色譜操作,一、薄層板的制備 1.固定相 a.未改性固定相 硅膠為使用最廣泛的薄層材料 氧化鋁有堿性、中性、酸性 硅藻土為化學(xué)中性吸附劑 纖維素天然多糖類 聚酰胺為特殊類型有機(jī)薄層材料，對(duì)能形成氫鍵的物質(zhì)有特別的選擇性,b.表面改性固定相 疏水改性硅膠化學(xué)鍵合烷基 親水改性硅膠引入氨基、氰基、二羥基等 表面改性纖維素乙?；w維素 c.藥典收載的固定相有： 硅膠類、硅藻土類、氧化鋁類、微晶纖維素類等。顆粒直徑一般要求10 40 m。,2.載板玻璃板，放在飽和碳酸鈉溶液中浸泡數(shù)小時(shí)，除去玻璃表面的油污。然后充分

4、漂洗干凈，干燥，置于干燥器中備用。要求光滑、平整、洗凈后不附水珠。 3.黏結(jié)劑 a.無機(jī)黏結(jié)劑石膏（硫酸鈣），添加石膏的吸附劑以字母“G”表示。沒有黏結(jié)劑的吸附劑以字母“H”表示。 無機(jī)黏結(jié)劑的優(yōu)點(diǎn)是：耐高溫，耐酸堿，但涂鋪薄板動(dòng)作要快，否則勻漿易凝固。薄層強(qiáng)度差。,b.有機(jī)黏結(jié)劑羧甲基纖維素鈉（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特點(diǎn)是薄層強(qiáng)度高、使用方便，但不能用濃硫酸顯色。 c.熒光指示劑在吸附劑中添加某種熒光指示劑 常用的熒光指示劑: 在254nm紫外光下發(fā)藍(lán)色熒光的有鈉熒光素、硫化鎘、陰極綠等。 在366nm有熒光的指示劑如彩藍(lán)等。 含有熒光指示劑的商品吸附劑以“F”表示，并

5、以下標(biāo)注明其激發(fā)光波長。例 :硅膠HF254,4.薄層板涂鋪要求：均勻、平整、無氣泡引起的凹陷和龜裂。 例： 硅膠板（粒度10 40m） 硅膠將硅膠置研缽中，加入少量水，研磨均勻，直至無結(jié)塊和氣泡，再加入比例量的水(一般為1份固定相與3份水)，迅速研磨均勻，立即涂鋪。 硅膠以CMC為黏合劑。配制0.2% 0.7%CMC水溶液,放置過夜,使懸浮的纖維沉降,取上層用來配制吸附劑勻漿。,手工簡易涂鋪,二、薄層板活化 涂布后的薄層先在室溫下陰干，在使用前在適當(dāng)溫度烘烤一定時(shí)間進(jìn)行活化，然后置干燥器中備用。不同薄層板活化條件略有不同，如： 硅膠 110 1h 氧化鋁 110 30min,三、點(diǎn)樣 1.要

6、求: 配制樣品的溶劑盡可能具有高度揮發(fā)性和非極性，否則易使斑點(diǎn)擴(kuò)展。 采用多次點(diǎn)加法，第二次點(diǎn)加時(shí)應(yīng)等前一次點(diǎn)加的溶劑揮發(fā)后再進(jìn)行。 2.點(diǎn)樣量: 應(yīng)適中，過載會(huì)引起斑點(diǎn)拖尾，分離度變差，以最小檢測(cè)量的幾倍幾十倍為宜。 3.手工點(diǎn)樣： 定容玻璃毛細(xì)管（1 -5ul），微量注射器。,四、展開 多數(shù)采用直線形上行展開，薄層板水平角度以75 為最佳。展開距離一般為10-15cm。 展開方式： 1.多次展開一次展開未達(dá)滿意分離時(shí)，可將薄層板干燥后再次用同一種溶劑展開，可重復(fù)多次，直到混合物分離為止。 2.分步展開混合物性質(zhì)差別較大時(shí)，一種流動(dòng)相不能有效分離時(shí)，可采用不同溶劑依次展開不同距離。,3.連續(xù)

7、展開使到達(dá)薄層上緣的溶劑不斷蒸發(fā)，連續(xù)展開以增加展開距離。因無溶劑前沿，需要有個(gè)參照物同時(shí)展開，以計(jì)算相對(duì)保留值。 4.二維展開在兩個(gè)垂直的方向上進(jìn)行展開。將樣品點(diǎn)在薄層板的一個(gè)角上，展開適當(dāng)距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開方向成90 的方向進(jìn)行展開。,五、檢測(cè) 物理方法紫外光下顯示熒光或熒光淬滅。 化學(xué)方法加化學(xué)試劑顯色，要求顯色穩(wěn)定、持久、專屬、靈敏、線性良好。 斑點(diǎn)定位方法 碘蒸氣法靈敏、簡便，為通用顯色法 將碘結(jié)晶放在密封的展開缸中，碘的升華，使缸內(nèi)充滿紫色的碘蒸氣。將展開后的板揮干溶劑，置碘缸中至薄層色譜上出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)。放置時(shí)間不宜太長，否則背景吸附劑也吸附碘，使信噪比降低。用

8、針頭將斑點(diǎn)標(biāo)記下來，放在通風(fēng)處使碘揮發(fā)。,4.3 薄層色譜參數(shù),一、保留參數(shù) 1. Rf值 用來表征斑點(diǎn)位置的基本參數(shù)是比移值，用Rf表示。 Rf=Ls/L0,原點(diǎn),S,R,W,Ls,L0,Lr,原點(diǎn),參比,樣品,前沿,注意： 同一物質(zhì)在不同展開方式中得到的比移值是不相同的。 在同樣溶劑的重復(fù)n次的多次展開后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n 2. 相對(duì)比移值（Rx） 在難以確定溶劑前沿的位置時(shí)，需要引入相對(duì)比移值（Rx） Rx=Ls/Lr,二、分離效能參數(shù) 1.理論塔板數(shù) n=16Ls/W 2 ，考慮靜態(tài)擴(kuò)散對(duì)起始斑點(diǎn)半峰寬的影響引入真實(shí)塔板數(shù)（n真實(shí) ） n真實(shí) =5.54Ls/（b0

9、.5 - b0 ） 2 b0.5為樣品斑點(diǎn)半峰寬， b0樣品起始斑點(diǎn)半峰寬 塔板高度h真實(shí)= Ls/ n真實(shí),2.容量因子（k） k=ts/ tm（物質(zhì)在兩相中滯留時(shí)間之比） 又k=K（Vs/ Vm） Rf=Vm/（Vm+KVs）=1/（1+k） k 9 4 2 1 0.5 0 Rf 0 0.1 0.2 0.33 0.5 0.67 1,3.分離度 R= 因Ls=Rf L0，同時(shí)對(duì)相鄰的兩個(gè)斑點(diǎn)，假定W1=W2=W 則R= L0 = Rf 與n=16Ls/W 2式合并，得：,Rf與R之間存在著如圖所示關(guān)系：,Rf=0.3,R最高 Rf在0.2-0.5,R變化不大 Rf0.1或0.7,R下降,4.

10、4 流動(dòng)相與固定相,液-固吸附 在該色譜中，溶質(zhì)的保留和分離選擇性決定于三個(gè)因素：,溶 解 能 力,相互作用,液-液分配 基于組分在互不相溶的兩相間的溶解度不同而實(shí)現(xiàn)分離的薄層系統(tǒng)?？稍谡归_前，將薄層板浸入某種液體固定相。 此外還有：離子交換、離子對(duì)色譜、凝膠、膠束等。,一、溶劑強(qiáng)度參數(shù)和選擇原則 1.溶劑的強(qiáng)度參數(shù) 溶劑強(qiáng)度參數(shù)用表示。流動(dòng)相強(qiáng)度越高，表示它與吸附劑相互作用力強(qiáng)。溶質(zhì)的Rf值就越大。 要得到滿意的分離，選用的流動(dòng)相使溶質(zhì)的Rf值在0.3 0.7之間為宜。 溶劑強(qiáng)度也可用其在水中的溶解度參數(shù)來表示。,一些常用溶劑的溶劑強(qiáng)度與溶解度參數(shù) 溶劑 溶劑 正己烷 0.01 7.3 環(huán)己

11、烷 0.04 8.2 苯 0.32 9.2 乙醚 0.38 7.4 二氯甲烷 0.42 9.6 正丙醇 0.82 10.2 正丁醇 0.70 / 四氫呋喃 0.57 9.1 乙酸乙酯 0.58 8.6 氯仿 0.40 9.1 甲乙酮 0.51 / 二氧六環(huán) 0.56 9.8 吡啶 0.71 10.4 丙酮 0.50 9.4 乙醇 0.88 / 乙酸 1.00 12.4 二甲亞砜 0.75 12.8 甲醇 0.95 12.9 乙二醇 1.11 14.7 甲酰胺 / 17.9,2.流動(dòng)相選擇時(shí)需考慮溶劑的下列情況： 一些溶劑如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保護(hù)劑，有時(shí)需重蒸除去乙醇。 許多溶劑有吸濕

12、性，使溶劑含水量不一致，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)難以重現(xiàn)。 混合流動(dòng)相組分之間（或雜質(zhì)）可能發(fā)生相互作用。 對(duì)于易揮發(fā)的溶劑，難以配制穩(wěn)定組成的流動(dòng)相。同時(shí)混合流動(dòng)相不應(yīng)重復(fù)使用。,3.斑點(diǎn)的擴(kuò)散與形狀 a.在TLC中斑點(diǎn)的移動(dòng)與擴(kuò)散是二維的 斑點(diǎn)在展開方向和與之垂直方向上的擴(kuò)散速度不相等，展開劑的移動(dòng)速度也是不等的，在單位體積或單位質(zhì)量薄層內(nèi)所含的溶劑量越接近溶劑前沿，擴(kuò)散速度減少得越明顯，直至溶劑前沿時(shí)為零，這一現(xiàn)象稱為“溶劑的體積梯度”，在各種展開形式中均存在。,b. 一種成分的色譜行為會(huì)受到混合物中其他成分的影響，這種影響的大小取決于混合組分的種類、濃度等因素。 這種影響一般使分配系數(shù)變小。如兩個(gè)相鄰

13、斑點(diǎn)中后面的一個(gè)比移值較其單獨(dú)展開時(shí)為大。,二、固定相的活度及其調(diào)節(jié) 在其它因素一定時(shí)，活度增加，Rf值減少?？赏ㄟ^預(yù)吸附溶劑分子，調(diào)節(jié)其表面活性。 例如可將活化薄層板放在相對(duì)濕度恒定的空間里來達(dá)到調(diào)節(jié)活度的目的。 實(shí)際工作中常常使固定相預(yù)吸附一定量單一或混合溶劑蒸氣，預(yù)吸附量越大，溶劑前沿運(yùn)動(dòng)速度越快，被測(cè)物質(zhì)斑點(diǎn)的Rf值越大。,同一物質(zhì)在同一薄層板上出現(xiàn)中間部分的Rf值比邊緣的Rf值小，稱為邊緣效應(yīng)。 在層析過程中發(fā)生的邊緣效應(yīng)就是由于活度變化引起的。尤其是使用混合溶劑時(shí)，極性較低和沸點(diǎn)較低的溶劑，在薄層邊緣容易揮發(fā)，使邊緣部分的展開劑中極性溶劑的比例增大，Rf相對(duì)增大。 若在展開前先將展

14、開槽與薄層板用展開劑蒸氣飽和后再展開，邊緣效應(yīng)可消失。,采用雙槽層析缸進(jìn)行飽和,邊緣效應(yīng)示意圖,4.5 薄 層 掃 描,一、原理 薄層定量方法可分為 直接法測(cè)定照射光照射色譜后，因被測(cè)物斑點(diǎn)的存在引起的透射光和反射光的變化。 間接法將部分照射光的能量轉(zhuǎn)換成較長波長的熒光，即熒光測(cè)量。 注意：薄層色譜定量測(cè)定的光學(xué)方法是基于測(cè)量斑點(diǎn)和薄層空白處光學(xué)響應(yīng)信號(hào)的差值。,二、測(cè)量方式 1.吸光度測(cè)量測(cè)定的是漫反射光。適合于本身有顏色或有紫外吸收的物質(zhì)。,I0,IR,檢 測(cè) 器,2.熒光測(cè)量靈敏度較吸光度測(cè)量高，板層不吸收發(fā)射光，測(cè)量噪音小，基線穩(wěn)定。 為消除激發(fā)光的影響，在板層和檢測(cè)器之間必須加一塊濾

15、光片，以截去反射激發(fā)光，只讓發(fā)射的熒光抵達(dá)檢測(cè)器。,濾光片,熒光,3.熒光淬滅測(cè)量吸附劑有熒光，樣品斑點(diǎn)無熒光，在紫外光照射下，被測(cè)物在熒光背景上顯示出暗灰斑點(diǎn)。本法適合于本身無顏色，又無特征紫外吸收或熒光的物質(zhì)。有三種形式：,三、掃描儀 1.機(jī)械掃描儀可進(jìn)行吸光度和熒光測(cè)量，以反射測(cè)量方式為主，也有能提供透射測(cè)量方式的。 2.高速掃描系統(tǒng)可分為兩類 光柵掃描系統(tǒng) 位敏掃描系統(tǒng),各種薄層掃描儀,4.6 定性、定量方法,一、定性方法 1.利用保留值 測(cè)定Rf值 測(cè)定相對(duì)Rf值，即Rx值。 利用二維色譜（改變色譜條件，比較Rf值是否一致）,s,b1,b2,b2,s,b1,s,b1,b2,點(diǎn)樣,第一

16、次展開,第二次展開,2.通過板上化學(xué)反應(yīng) 反應(yīng)后生成特征顏色的化合物。 反應(yīng)后生成復(fù)雜的混合物，根據(jù)生成物的“指紋”特征加以鑒定。 可用于定性的板上反應(yīng)有：乙酰化、濃硫酸脫水、偶氮化、酯化、鹵化、酸堿水解、硝化、氧化還原、熱解和光化學(xué)反應(yīng)等。 通過加熱、噴霧等方法施加反應(yīng)試劑。,3.通過板上光譜圖定性 直接測(cè)定薄層板上斑點(diǎn)的紫外或可見吸收光譜圖，與平行點(diǎn)加的標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)的圖譜對(duì)照。 可建立標(biāo)準(zhǔn)條件下的化合物的光譜圖庫，用計(jì)算機(jī)檢索定性。,二、定量方法 1.間接定量將薄層分離后物質(zhì)斑點(diǎn)定量地洗脫下來，再對(duì)洗脫液定量測(cè)定。 分光光度法、HPLC法、GC法、質(zhì)譜法 2.直接定量 斑點(diǎn)面積測(cè)量用透明紙覆蓋

17、在薄層表面，描出斑點(diǎn)界限，然后測(cè)量其面積。 目測(cè)法比較系列標(biāo)準(zhǔn)與樣品的斑點(diǎn)面積大小、顏色深淺，得到樣品的含量范圍。 3.薄層掃描儀掃描定量,4.7 應(yīng) 用,一、可用于判斷兩個(gè)化合物是否相同（同一展開條件下是否有相同的比移值）。 二、可用于確定混合物中含有的組分?jǐn)?shù)。 三、可用于為柱色譜選擇合適的展開劑，監(jiān)測(cè)柱色譜分離狀況和效果。 四、可用于監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。,應(yīng)用舉例： 藥物鑒別 例:在毒物分析中檢驗(yàn)是否巴比妥安眠藥中毒時(shí)，取胃內(nèi)容物或尿樣品，先用鹽酸酸化后，用乙醚提取，乙醚提取液脫水，過濾蒸干，溶于無水乙醇中，點(diǎn)在硅膠板上用氯仿-無水乙醇（36：1）展開，用硫酸汞二苯偶碳酰肼試劑顯色，并用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，依次見出巴比妥，苯巴比妥，戊巴比妥和異巴比妥。鑒別速度快（1小時(shí)），這對(duì)于搶救中毒患者和及時(shí)為醫(yī)生提供治療方案極為重要。,監(jiān)測(cè)反應(yīng) 例:在合成強(qiáng)力霉素的過程中，需要中間體甲烯土霉素氫化為脫氧土霉素。 可用薄層檢查氫化反應(yīng)是否完全，如果反應(yīng)完全，則反應(yīng)釜中幾乎沒有或只有極少量的甲烯土霉素存在，薄層板上只顯示出一個(gè)脫氧土霉素，如果薄層板上有兩個(gè)明顯的斑點(diǎn)，表示反應(yīng)還沒有完全，直到只顯示出脫氧土霉素的一個(gè)斑點(diǎn)為止才能出料。,TLC應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品和食品中生物堿類、氨