1、第二章 色譜分析方法導論 一、 概述 歷史、色譜分離過程、分類 二、色譜流出曲線 色譜圖及相關術語 三、色譜法基本原理 描述分配過程參數(shù)、峰間距、峰形狀和峰寬的理論描述(塔板理論及速率理論) 四、分離度及色譜分離方程 分離度及色譜分離方程、影響分離的因素 五、色譜常用的定性定量方法 色譜分析中常采用的定性與定量分析方法,一、 概述 化學分析方法的基本要求是其選擇性要高。即，在分析過程中，待測物與潛在的干擾物的分離是最為重要的步驟！ 20 世紀中期，大量采用一些經(jīng)典的分離方法：沉淀、蒸餾和萃取 現(xiàn)代分析中，大量采用色譜和電泳分離方法。迄今為止，色譜方法是最為有效的分離手段，其應用涉及每個科學領域

2、。 歷史：1903年，俄國植物學家Mikhail Tswett 最先發(fā)明。他采用填充有固體CaCO3細粒子的玻璃柱，將植物色素的混合物（葉綠素和葉黃素 chlorophylls “graphein”=write) 。 50年代，色譜發(fā)展最快（一些新型色譜技術的發(fā)展；復雜組分分析發(fā)展的要求。 1937-1972年，15年中有12個Nobel獎是有關色譜研究的。,A.J.P. Martin R.L.M. Synge 1952年化學Nobel獎 開創(chuàng)了氣相色譜法。,(一) 色譜分離基本原理： 使用外力使含有樣品的流動相（氣體、液體或超臨界流體）通過一固定于柱或平板上、與流動相互不相溶的固定相表面。樣

3、品中各組份在兩相中進行不同程度的作用。與固定相作用強的組份隨流動相流出的速度慢，反之，與固定相作用弱的組份隨流動相流出的速度快。由于流出的速度的差異，使得混合組份最終形成各個單組份的“帶(band)”或“區(qū)(zone)”，對依次流出的各個單組份物質可分別進行定性、定量分析。 (二）色譜分類方法： 1. 按固定相外形分： 柱色譜（填充柱、空心柱）、平板色譜（薄層色譜和紙色譜。,2. 按兩相狀態(tài)分,3. 按色譜分離的機理分 利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。 利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達到分離的方法稱為分配色譜法。 利用組分在離子交換劑（

4、固定相）上的親和力大小不同而達到分離的方法，稱為離子交換色譜法。 利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方法，稱為凝膠色譜法或空間排阻色譜法。 最近，又有一種新分離技術，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進行分離的技術稱為親和色譜法，常用于蛋白質的分離。,4. 按照展開程序分類 按照展開程序的不同，可將色譜法分為洗脫法、頂替法、和迎頭法。 （1）洗脫法也稱沖洗法。工作時，首先將樣品加到色譜柱頭上，然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分離。流出曲線下圖。,這

5、種方法能使樣品的各組分獲得良好的分離，色譜峰清晰。此外，除去沖洗劑后，可獲得純度較高的物質。目前，這種方法是色譜法中最常用的一種方法。,（2）頂替法是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流動相中加入對固定相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強的物質為頂替劑（或直接用頂替劑作流動相），通過色譜柱，將各組分按吸附或溶解能力的強弱順序，依次頂替出固定相。很明顯，吸附或溶解能力最弱的組分最先流出，最強的最后流出。頂替法的流出曲線如下圖。,此法適于制備純物質或濃縮分離某一組分；其缺點是經(jīng)一次使用后，柱子就被樣品或頂替劑飽和，必須更換柱子或除去被柱子吸附的物質后，才能再使用。,（3）迎頭法是將試樣混合物連續(xù)通過色譜柱

6、，吸附或溶解能力最弱的組分首先一純物質的狀態(tài)流出，其次則以第一組分和吸附或溶解能力較弱的第二組分混合物，以此類推。流出曲線如下圖。,該法在分離多組分混合物時，除第一組分外，其余均非純態(tài)，因此僅適用于從含有微量雜質的混合物中切割出一個高純組分（組分A），而不適用于對混合物進行分離。,A,A+ B,二、 色譜流出曲線（色譜圖） 色譜流出曲線 由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。 如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內，則色譜峰是對稱的。,色譜流出曲線（色譜圖） 混合組分的分離過程及檢測器對各

7、組份在不同階段的響應,色譜術語： 1）基線：在實驗條件下，色譜柱后僅有純流動相進入檢測器時的流出曲線稱為基線，S/N大的、穩(wěn)定的基線為水平直線。 2）峰高：色譜峰頂點與基線的距離。,3）保留值(Retention value, R) a. 死時間(Dead time, t0) ：不與固定相作用的物質從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間，它與色譜柱的空隙體積成正比。由于該物質不與固定相作用，因此，其流速與流動相的流速相近。據(jù) t0 可求出流動相平均流速,b. 保留時間tr：試樣從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。它包括組份隨流動相通過柱子的時間t0和組份在固定相中滯留的時間。 c. 調整保留時間 ：某組份的保

8、留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間。即 由于時間為色譜定性依據(jù)。但同一組份的保留時間與流速有關，因此有時需用保留體積來表示保留值。 d. 死體積V0：色譜柱管內固定相顆粒間空隙、色譜儀管路和連接頭間空隙和檢測器間隙的總和。勿略后兩項可得到： 其中，F(xiàn)co為柱出口的載氣流速（mL/min)，其值為： F0-檢測器出口流速；Tr-室溫；Tc-柱溫；p0-大氣壓；pw-室溫時水蒸汽壓。,e. 保留體積Vr：指從進樣到待測物在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。 f. 調整保留體積 ：某組份的保留體積扣除死體積后的體積。 g. 相對保留值r2,1：組份2的調整保留值與組份

9、1的調整保留值之比。 注意： r2,1只與柱溫和固定相性質有關，而與柱內徑、柱長L、填充情況及流動相流速無關，因此，在色譜分析中，尤其是GC中廣泛用于定性的依據(jù)！ 具體做法：固定一個色譜峰為標準s，然后再求其它峰 i 對標準峰的相對保留值，此時以 表示： 1, 又稱選擇因子(Selectivity factor)。,h. 區(qū)域寬度：用于衡量柱效及反映色譜操作條件下的動力學因素。通常有三種表示方法： 標準偏差：0.607倍峰寬處的一半。 半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354 峰底寬W：色譜峰兩側拐點上切線與基線的交點間的距離。W= 4 色譜流出曲線的意義： 色譜峰數(shù)=樣品中單組

10、份的最少個數(shù)； 色譜保留值定性依據(jù)； 色譜峰高或面積定量依據(jù)； 色譜保留值或區(qū)域寬度色譜柱分離效能評價指標； 色譜峰間距固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。,三、 色譜法基本原理 兩組份峰間距足夠遠：由各組份在兩相間的分配系數(shù)決定，即由色譜過程的 熱力學性質決定。 每個組份峰寬足夠?。河山M份在色譜柱中的傳質和擴散決定，即由色譜過程 動力學性質決定。 因此，研究、解釋色譜分離行為應從熱力學和動力學兩方面進行。 （一）描述分配過程的參數(shù) 分配系數(shù)(Distribution constant, K)： 描述組份在固定相和流動相間的分配過程或吸附-脫附過程的參數(shù)，稱為分配系數(shù)。 K 只與固定相和溫度有關

11、，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關。,2. 分配比(Retention factor or capacity factor, k)： 在一定溫度和壓力下，組份在兩相間的分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比，稱為分配比它反映了組分在柱中的遷移速率。又稱保留因子。 其中VmV0，Vs為固定相體積。 分配比 k 的求算： 1）組分滯留因子： 2）又， 3）因此，,3. K 與 k 的關系： 稱為相比率，它也是反映色譜柱柱型特點的參數(shù)。對填充柱，=635；對毛細管柱， =60600。 4. 選擇因子 ：色譜柱對A、B兩組分的選擇因子 定義如下： A為先流出的組分，B為后流出的組分。,4. 分

12、配系數(shù) K 及分配比 k 與選擇因子的關系 對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示： = tr (B) / tr (A) = k（A） / k（B） =K（A） / K（B） 注意：K 或 k 反映的是某一組分在兩相間的分配；而 是反映兩組分間的分離情況！當兩組分 K 或 k 相同時， =1 時，兩組分不能分開；當兩組分 K 或 k 相差越大時， 越大，分離得越好。也就是說，兩組分在兩相間的分配系數(shù)不同，是色譜分離的先決條件。 和 k 是計算色譜柱分離效能的重要參數(shù)！(熱力學和動力學的結合) 下圖是 A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓。,KA KB,A,B,A,B,濃度,沿柱移動距

13、離 L,溶質A和B在沿柱移動時不同位置處的濃度輪廓,圖中KAKB ，因此，A組分在移動過程中滯后。隨著兩組分在色譜柱中移動距離的增加，兩峰間的距離逐漸變大，同時，每一組分的濃度輪廓（即區(qū)域寬度）也慢慢變寬。顯然，區(qū)域擴寬對分離是不利的，但又是不可避免的。若要使A、B組分完全分離，必須滿足以下三點： 第一，兩組分的分配系數(shù)必須有差異；(熱力學特性) 第二，區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分離的速度；(動力學特性) 第三，在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。 第一、二點是完全分離的必要條件。作為一個色譜理論，它不僅應說明組分在色譜柱中移動的速率，而且應說明組分在移動過程中引起區(qū)域擴寬的各種因素。塔

14、板理論和速率理論均以色譜過程中分配系數(shù)恒定為前提，故稱為線性色譜理論。,（二）峰間距、峰形狀和峰寬的理論描述 1. 塔板理論（Plate theory) 1952年，Martin等人提出的塔板理論將一根色譜柱當作一個由許多塔板組成的精餾塔，用塔板概念來描述組分在柱中的分配行為。塔板是從精餾中借用的，是一種半經(jīng)驗理論，但它成功地解釋了色譜流出曲線呈正態(tài)分布。 塔板理論假定： 1）塔板之間不連續(xù)； 2）塔板之間無分子擴散； 3）組分在各塔板內兩相間的分配瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論塔板高度H； 4）某組分在所有塔板上的分配系數(shù)相同； 5）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入

15、。 當塔板數(shù)n較少時，組分在柱內達分配平衡的次數(shù)較少，流出曲線呈峰形，但不對稱；當塔板數(shù)n50 時，峰形接近正態(tài)分布。,根據(jù)呈正態(tài)分布的色譜流出曲線可以導出計算塔板數(shù)n的公式，用以評價一根柱子的柱效。由于色譜柱并無真正的塔板，故塔板數(shù)又稱理論塔板數(shù)： 可見理論塔板數(shù)由組分保留值和峰寬決定。 若柱長為L，則每塊理論塔板高度H為 由上述兩式知道，理論塔板數(shù)n越多、理論塔板高度H越小、色譜峰越窄，則柱效越高。 但上述兩式包含死時間t0，它與組分在柱內的分配無關，因此不能真正反映色譜柱的柱效。通常以有效塔板數(shù)neff 和有效塔板高度Heff 表示：,有關塔板理論的說明： 1）說明柱效時，必須注明該柱效

16、是針對何種物質、固定液種類及其含量、流動相種類及流速、操作條件等； 2）應定期對柱效進行評價，以防柱效下降、延長柱壽命。 3）塔板理論描述了組分在柱內的分配平衡和分離過程、導出流出曲線的數(shù)學模型、解釋了流出曲線形狀和位置、提出了計算和評價柱效的參數(shù)。 但該理論是在理想情況下導出的，未考慮分子擴散因素、其它動力學因素對柱內傳質的影響。因此它不能解釋： 峰形為什么會擴張？ 影響柱效（板高）的動力學因素是什么？ 不同的流動相流速下為什么具有不同的柱效？,2. 速率理論（Rate theory） 1956年，荷蘭化學工程師van Deemter提出了色譜過程動力學速率理論：吸收了塔板理論中的板高H概念

17、，考慮了組分在兩相間的擴散和傳質過程，從而給出了van Deemter方程： u 為流動相線速度； A，B，C為常數(shù)，其中 A分別表示渦流擴散系數(shù)； B分子擴散系數(shù)； C傳質阻力系數(shù)（包括液相和固相傳質阻力系數(shù)）。 該式從動力學角度很好地解釋了影響板高（柱效）的各種因素！任何減少方程右邊三項數(shù)值的方法，都可降低H，從而提高柱效。,1）渦流擴散項(Multipath term, A) 在填充柱中，由于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”：從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性同一組分運行路線長短不同流出時間不同峰形展寬。 展寬程度以A表示： A=2

18、dp 其中dp填充物平均直徑；填充不規(guī)則因子。,可見，使用細粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。對于空心毛細管柱，無渦流擴散，即A=0。,流動方向,2）分子擴散項(Longitudinal diffusion term, B/u) 縱向分子擴散是由于濃度梯度引起的。當樣品被注入色譜柱時，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進， “塞子”因濃度梯度而向前后自發(fā)地擴散，使譜峰展寬。其大小為 B=2D 稱為彎曲因子，它表示固定相幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況； D組分在流動相中的擴散系數(shù)。組份為氣體或液體時，分別以Dg或Dm表示； 討論： 分子量大的組分，Dg小，即B小 Dg 隨柱溫升高而增加，

19、隨柱壓降低而減?。?流動相分子量大，Dg 小，即 B ??； u 增加，組份停留時間短，縱向擴散小；（B/u） 對于液相色譜，因Dm 較小，B 項可勿略。,球狀顆粒； 大分子量流動相； 適當增加流速； 短柱； 低溫。,2）分子擴散項(Longitudinal diffusion term, B/u),縱向分子擴散使峰展寬 （a）柱內譜帶構形 （b）相應的響應信號,（a）,（b）,3）傳質阻力項(Mass-transfer term, Cu) 因傳質阻力的存在，使分配不能“瞬間”達至平衡，因此產(chǎn)生峰形展寬。氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，二者傳質過程不完全相同。下面分別作討論。 a

20、）氣液色譜：傳質阻力項C包括氣相傳質阻力系數(shù)Cs和液相傳質阻力系數(shù)Cl。,討論： 減小填充顆粒直徑dp； 采用分子量小的流動相，使Dg增加； 減小液膜厚度df，Cl下降。但此時k又減小。 因此，當保持固定液含量不變時，可通過 增加固定液載體的比表面來降低df。但比 表面過大又會因吸附過強使峰拖尾。 增加柱溫，可增加Dl，但k值也減小，為保 持合適Cl值，應控制柱溫。,b）液液色譜：傳質阻力項C包括流動相傳質阻力系數(shù)Cm和固定相傳質阻力系數(shù)Cs。 討論： 流動相傳質阻力包括兩方面：流動相中的傳質阻力Cm、滯留的流動相傳質阻Cs力。分別與填充物大小 dp、擴散系數(shù)(Dm)、微孔大小及其數(shù)量等有關。

21、 因此，降低流動相傳質阻力的方法有：細顆粒固定相、增加組分在固定相和流動相中的擴散系數(shù)D、適當降低線速度、短柱。 固定相傳質阻力與液膜厚度df、保留因子 k 和擴散系數(shù)Ds等有關。 因此，降低固定相傳質阻力的方法有：與氣液色譜中的表述相同。,sm,5）固定相顆粒大小對板高的影響 實驗表明，顆粒越細，板高越小，受線速影響越小。即，在HPLC分析中采用細粒作固定相的理論根據(jù)！ 但顆粒細導致柱流速慢，當采用高壓技術，才能實現(xiàn)HPLC的分析要求。 上面分別介紹了影響色譜分離的基本原理以及影響柱效的各種因素，但是如何從總體上定量描述色譜分離效能？如何將各種影響因素對分離的影響定量地表述出來呢？,板高,

22、H(cm),四、 分離度及色譜分離方程 （一）分離度(Resolution, R) 同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標。也稱總分離效能指標或分辨率。其定義為： 利用此式，可直接從色譜流出曲線上求出分離度R。 R 越大，相鄰組分分離越好。當R=1.5時，分離程度可達99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開的判據(jù)。,（二）色譜分離方程 R 的定義并未反映影響分離度的各種因素。也就是說，R 未與影響其大小的因素：柱效n、選擇因子 和保留因子 k 聯(lián)系起來。 對于相鄰的難分離組分，由于它們的分配系數(shù) K 相差小，可合理假設k1k2=k，W1 W2=W。因此可導出R與n（neff）、 和 k 的

23、關系：,附：具體推導過程如下：,有關色譜方程的討論： 1）分離度R與柱效的關系 分離度R與理論塔板數(shù)n有關，即R受熱力學性質的影響。 對具一定相對保留值的物質對，R與有效塔板數(shù)neff有關，說明neff可正確代表柱效能。 由色譜方程可得： 因此可通過增加柱長提高分離度。然而，分析時間也相應增加，且峰寬也展寬！為提高柱效，用減小塔板高度H的方法比增加柱長更有效。 2）分離度R與保留因子的關系 越大，柱選擇性越好，對分離有利。 的微小變化可引起 R 較大改變。如當 從1.01增加至1.10(增加9%)時，R 則增加 9 倍(但1.5, R增加不大) 。 改變 的方法有：降低柱溫、改變流動相及固定相

24、的性質和組成。 3）分離度R分配比k的關系 k增加，分離度R增加，但當k10，則R的增加不明顯。通常k在210之間。 改變 k 的方法有：增加柱溫(GC)、流動相性質和組成(LC)以及固定相含量。,70%CH3OH +30H2O,60%CH3OH +40H2O,50%CH3OH +50H2O,40%CH3OH +60H2O,溶劑(流動相)組成對色譜分離的影響,1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌 4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌；,改變組成 使 k 最佳,色譜分離中的問題 由于分析物組成復雜，以某組成的流動相可能使

25、部分待測物得到好的分離，但同時出使其它待測物的分離不令人滿意！實際工作中采用程序升溫（GC）和梯度淋洗（LC）來解決這個問題。,概念、表示方法及計算公式匯總,表-1,表-2,五、色譜定性和定量分析,（一 ）色譜的定性分析 色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。但是不同物質在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非專屬的。因此僅根據(jù)保留值對一個完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來源、性質、分析目的的基礎上，對樣品組成作初步的判斷，再結合下列的方法則

26、可確定色譜峰所代表的化合物。,1. 利用純物質對照定性 在一定的色譜條件下，一個未知物只有一個確定的保留時間。因此將已知純物質在相同的色譜條件下的保留時間與未知物的保留時間進行比較，就可以定性鑒定未知物。若二者相同，則未知物可能是已知的純物質；不同，則未知物就不是該純物質。 純物質對照法定性只適用于組分性質已有所了解，組成比較簡單，且有純物質的未知物。,2. 相對保留值法 相對保留值is 是指組分i與基準物質s調整保留值的比值 is = tri / trS= Vri / Vrs 它僅隨固定液及柱溫變化而變化，與其它操作條件無關。 相對保留值測定方法：在某一固定相及柱溫下，分別測出組分i和基準物

27、質s的調整保留值，再按上式計算即可。,3. 加入已知物增加峰高法 當未知樣品中組分較多，所得色譜峰過密，用上述方法不易辨認時，或僅作未知樣品指定項目分析時均可用此法。首先作出未知樣品的色譜圖，然后在未知樣品加入某已知物，又得到一個色譜圖。峰高增加的組分即可能為這種已知物。,4. 保留指數(shù)定性法 保留指數(shù)又稱為柯瓦（Kovts）指數(shù)，它表示物質在固定液上的保留行為，是目前使用最廣泛并被國際上公認的定性指標。它具有重現(xiàn)性好、標準統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點。 保留指數(shù)也是一種相對保留值，它是把正構烷烴中某兩個組分的調整保留值的對數(shù)作為相對的尺度，并假定正構烷烴的保留指數(shù)為n100。被測物的保留指數(shù)值可用

28、內插法計算。,內插法求IiX示意圖,信號,tR(Z),tR(i),tR(Z+1),t,進樣,例如，若確定物質i在某固定液X上的保留指數(shù)IiX 的數(shù)值。先選取兩個正構烷烴作為基準物質，其中一個的碳數(shù)為Z，另一個為Z+1，它們的調整保留時間分別為tR(Z) 和 tR(Z+1) ，使被測物質i的調整保留時間tR(i)恰好于兩者之間，即tR(Z) tR(i) tR(Z+1) 。將含物質i和所選的兩個正構烷烴的混合物注入其固定液X的色譜柱，在一定溫度條件下繪制色譜圖。,大量實驗數(shù)據(jù)表明，化合物調整保留時間的對數(shù)值與其保留指數(shù)間的關系基本上是一條直線關系。據(jù)此，可用內插法求算IiX 。 IiX = 100

29、Z +（lg tR(i) - lg tR(Z)）/（lg tR(Z+1) - lg tR(Z)） 保留指數(shù)的物理意義在于：它是與被測物質具有相同調整保留時間的假想的正構烷烴的碳數(shù)乘以100。保留指數(shù)僅與固定相的性質、柱溫有關，與其它實驗條件無關。其準確度和重現(xiàn)性都很好。,(二)定量分析 定量分析的任務是求出混合樣品中各組分的百分含量。色譜定量的依據(jù)是，當操作條件一致時，被測組分的質量（或濃度）與檢測器給出的響應信號成正比。即： i = fi Ai 式中i為被測組分i的質量； Ai為被測組分i的峰面積； fi為被測組分i的校正因子。 可見，進行色譜定量分析時需要： （1）準確測量檢測器的響應信號

30、 峰面積或峰高； （2）準確求得比例常數(shù) 校正因子； （3）正確選擇合適的定量計算方法，將測得的峰面積或 峰高換算為組分的百分含量。,（1）對稱形峰面積的測量 峰高乘以半峰寬法 對稱峰的面積 A = 1.065 h W1/2 （2）不對稱形峰面積的測量 峰高乘平均峰寬法 對于不對稱峰的測量如仍用峰高乘以半峰寬，誤差就較大，因此采用峰高乘平均峰寬法。 A = 1/2 h（W0.15 + W0.85） 式中W0.15 和 W0.85分別為峰高0.15倍和0.85倍處的峰寬。,1. 峰面積測量方法 峰面積是色譜圖提供的基本定量數(shù)據(jù)，峰面積測量的準確與否直接影響定量結果。對于不同峰形的色譜峰采用不同的

31、測量方法。,2. 定量校正因子 色譜定量分析的依據(jù)是被測組分的量與其峰面積成正比。但是峰面積的大小不僅取決于組分的質量，而且還與它的性質有關。即當兩個質量相同的不同組分在相同條件下使用同一檢測器進行測定時，所得的峰面積卻不相同。因此，混合物中某一組分的百分含量并不等于該組分的峰面積在各組分峰面積總和中所占的百分率。這樣，就不能直接利用峰面積計算物質的含量。為了使峰面積能真實反映出物質的質量，就要對峰面積進行校正，即在定量計算是引入校正因子。 校正因子分為絕對校正因子和相對校正因子。 fi = mi / Ai 式中fi值與組分i質量絕對值成正比，所以稱為絕對校正因子。在定量分析時要精確求出fi值

32、是比較困難的。一方面由于精確測量絕對進樣量困難；另一方面峰面積與色譜條件有關，要保持測定fi值時的色譜條件相同，既不可能又不方便。另外即便能夠得到準確的fi值，也由于沒有統(tǒng)一的標準而無法直接應用。為此提出相對校正因子的概念來解決色譜定量分析中的計算問題。,(1) 相對校正因子 相對校正因子定義為： fi = fi / fs 即某組分i的相對校正因子fi為組分i與標準物質s的絕對校正因子之比。 fi =（mi /Ai）/（ms/As）=（mi / ms）（As / Ai ） 可見，相對校正因子fi就是當組分i的質量與標準物質s相等時，標準物質的峰面積是組分i峰面積的倍數(shù)。若某組分質量為mi ，峰

33、面積Ai ，則fi Ai的數(shù)值與質量為mi的標準物質的峰面積相等。也就是說，通過相對校正因子，可以把各個組分的峰面積分別換算成與其質量相等的標準物質的峰面積，于是比較標準就統(tǒng)一了。這就是歸一法求算各組分百分含量的基礎。 (2) 相對校正因子的表示方法 上面介紹的相對校正因子中組分和標準物質都是以質量表示的，故又稱為相對質量校正因子；若以摩爾為單位，相對摩爾校正因子；若以體積為單位，相對體積校正因子。,(3) 相對校正因子的測定方法 相對校正因子值只與被測物和標準物以及檢測器的類型有關，而與操作條件無關。因此， fi 值可自文獻中查出引用。若文獻中查不到所需的fi 值，也可以自己測定。常用的標準物質，對熱導檢測器（TCD）是苯，對氫焰檢測器（FID）是正庚烷。 測定相對校正因子最好是用色譜純試劑。若無純品，也要確知該物質的百分含量。測定時首先準確稱量標準物質和待測物，然后將它們混合均勻進樣，分別測出其峰面積，再進行計算。,3. 定量計算方法 (1) 歸一化法 把所有出峰組分的含