1、第一章 細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理與技術(shù) 現(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn)為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價(jià)值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過(guò)程中很多是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的?；蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且訡HO細(xì)胞作為載體；細(xì)胞工程中更是離不細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因治療、體細(xì)胞治療也要經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程才能實(shí)現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān)?？傊?，細(xì)胞培養(yǎng)在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很

2、關(guān)鍵的核心作用。 第一節(jié) 體外培養(yǎng)的概念 一、基本概念 體外培養(yǎng)（in vitro culture），就是將活體結(jié)構(gòu)成分或活的個(gè)體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在類(lèi)似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長(zhǎng)和發(fā)育的方法。 組織培養(yǎng)：是指從生物體內(nèi)取出活的組織（多指組織塊）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 細(xì)胞培養(yǎng)：是指將活細(xì)胞（尤其是分散的細(xì)胞）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 器官培養(yǎng)：是指從生物體內(nèi)取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 二、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化 1.差異：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長(zhǎng)，易發(fā)生如下

3、變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無(wú)限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開(kāi)始發(fā)生了。 2.分化：體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細(xì)胞是否表現(xiàn)分化,關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，如Friend細(xì)胞（小鼠紅白血病細(xì)胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內(nèi)皮細(xì)胞在類(lèi)似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時(shí)能長(zhǎng)成血管狀結(jié)構(gòu)，雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生

4、特異的單克隆抗體，這些均屬于細(xì)胞分化行為。 第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程 一、準(zhǔn)備工作 準(zhǔn)備工作對(duì)開(kāi)展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無(wú)法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。 二、取材 在無(wú)菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?jīng)過(guò)一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過(guò)程稱(chēng)為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無(wú)取材這一過(guò)程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。 理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以

5、用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時(shí)，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4的培養(yǎng)液中保存。取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格保持無(wú)菌，同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時(shí)容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。 三、培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過(guò)程稱(chēng)為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示

6、）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。 正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好，形態(tài)是否正常，有無(wú)污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對(duì)培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時(shí)檢查。 原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數(shù)小時(shí)到數(shù)十天不等），在潛伏期細(xì)胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過(guò)了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長(zhǎng)期。細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱(chēng)為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無(wú)限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)

7、，也可能僅有不死性（Immortality）而無(wú)惡性。 四、凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度196，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無(wú)限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。 凍存過(guò)程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時(shí)溫度、融化速度等都對(duì)細(xì)胞活力有影響。 五、常用儀器設(shè)備 無(wú)菌室,超凈工作臺(tái),三重純水蒸

8、餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機(jī),無(wú)菌過(guò)濾器,洗刷裝置,細(xì)胞計(jì)數(shù)板和電子細(xì)胞技術(shù)儀等等。 第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌環(huán)境 一、無(wú)菌室 無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。 無(wú)菌室的消毒和防污染：為保持無(wú)菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（12小時(shí)），每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。實(shí)際工作中，要根據(jù)無(wú)菌室建筑材料的差異來(lái)選擇合適的消毒方法。 此外，還應(yīng)注意防止無(wú)菌室的污染。造成無(wú)菌室污染的可能包括：送入無(wú)菌室的風(fēng)沒(méi)有被過(guò)濾除菌；進(jìn)出無(wú)菌室

9、時(shí)，能使外界空氣直接對(duì)流進(jìn)無(wú)菌室的操作間；等。 二、超凈工作臺(tái) 工作原理：鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效過(guò)濾器得以?xún)艋?，凈化的空氣被徐徐吹過(guò)臺(tái)面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺(tái)的流動(dòng)方向不同，可將超凈工作臺(tái)分為側(cè)流式、直流式和外流式三種類(lèi)型。 超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)：超凈臺(tái)的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜，過(guò)大、過(guò)小均不利于保持凈化度；使用前最好開(kāi)啟超凈臺(tái)內(nèi)紫外燈照射1030分鐘，然后讓超凈臺(tái)預(yù)工作1015分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺(tái)無(wú)菌。還要定期用福爾馬林熏蒸

10、超凈臺(tái)。 第四節(jié) 常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒 細(xì)胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類(lèi)、紙類(lèi)等，因此掌握清洗、消毒知識(shí)，學(xué)會(huì)清洗、消毒方法是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作必須的。 一、清洗 離體條件下，有害物質(zhì)直接同細(xì)胞接觸，細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，達(dá)到不含任何殘留物的要求。 （一）玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過(guò)浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟。 1.浸泡:新的或用過(guò)的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5鹽酸浸泡過(guò)夜；用過(guò)的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂

11、，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。 2.刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。 3.浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱(chēng)酸液，通過(guò)酸液的強(qiáng)氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時(shí)，一般過(guò)夜或更長(zhǎng)。放取器皿要小心。 4.沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗23次，晾干或烘干后包裝備用。 （二）橡膠制品清洗 新的橡膠制品洗滌方

12、法：0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50烤干備用。 （三）塑料制品的清洗 塑料制品特點(diǎn)：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來(lái)水過(guò)夜，用紗布或棉簽和50清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（1520遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時(shí)，晾干備用。 （四）包裝:對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射

13、器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。 二、消毒和滅菌 微生物污染是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因 （一）物理消毒法 1.紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽(yáng)性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強(qiáng)。紫外線的直接作用是通過(guò)破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過(guò)紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡(jiǎn)單，效果好。 紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時(shí)間要適合。離地面2米的30W燈可照

14、射9平方米房間，每天照射23小時(shí)，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長(zhǎng)照射時(shí)間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺(tái)的距離不應(yīng)超過(guò)1.5米，照射時(shí)間30分鐘為宜。 紫外燈不僅對(duì)皮膚、眼睛傷害，且對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開(kāi)著紫外等操作。 2.高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對(duì)生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類(lèi)、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。 不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時(shí)間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應(yīng)立即放到60-70烤箱內(nèi)烘干

15、，再貯存?zhèn)溆茫駝t，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡(jiǎn)單、使用方便等特點(diǎn)。 3.高溫干熱消毒:干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160以上，并保持90120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。 干熱滅菌后要關(guān)掉開(kāi)關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開(kāi)，切忌立即打開(kāi)，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。 燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺(tái)面上的酒精燈的火焰對(duì)金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。 4.過(guò)濾除菌：是將液體或氣

16、體用微孔薄膜過(guò)濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí)，過(guò)濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程。 （二）化學(xué)消毒：新潔而滅，其0.1水溶液可對(duì)器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒。 （三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過(guò)程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。 可用于細(xì)胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。如常用的過(guò)濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實(shí)驗(yàn)室空氣

17、；多用新潔而滅消毒實(shí)驗(yàn)室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過(guò)濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。第二章 細(xì)胞培養(yǎng)液 現(xiàn)代生物技術(shù)均通過(guò)細(xì)胞作為載體來(lái)進(jìn)行，無(wú)論是基因治療、干細(xì)胞、克隆技術(shù)都在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的。細(xì)胞的生長(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)稱(chēng)為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細(xì)胞用的物質(zhì)，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在此環(huán)境中有生長(zhǎng)和繁殖的能力。它是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子及其他一些入核酸降解物、激素等。 隨著動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培

18、養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，作為細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中最基本的原料細(xì)胞培養(yǎng)基的用量也迅速增加，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)科和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如疫苗生產(chǎn)（人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產(chǎn)（如EPO、TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。 第一節(jié) 水與平衡鹽溶液 1.培養(yǎng)用水:體外培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)水質(zhì)特別敏感，對(duì)水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會(huì)含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾

19、的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。最好用龍頭瓶貯存，存放時(shí)間一般不應(yīng)超過(guò)2周。 2.緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。 第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求 體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿(mǎn)足細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分、促生長(zhǎng)因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。 一、營(yíng)養(yǎng)成分 維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件一般包括以下幾個(gè)方面： 1.氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴(lài)、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過(guò)程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來(lái)源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基

20、本物質(zhì)。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。 2.單糖：培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無(wú)氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。 體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。 3.維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。 4.無(wú)機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長(zhǎng)除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。 二、促生長(zhǎng)因子及激素 已證實(shí)：各種激素、生長(zhǎng)因子對(duì)于維持細(xì)

21、胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對(duì)許多細(xì)胞生長(zhǎng)有促生長(zhǎng)作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對(duì)某一類(lèi)細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)作用等。 三、滲透壓 細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260320mOsm/kg的范圍都適宜。 四、pH 氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供

22、給細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和合成各種成分。一些細(xì)胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。在開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)，一般置細(xì)胞于95空氣加5二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動(dòng)物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7274在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動(dòng)的加強(qiáng)，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結(jié)合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動(dòng)，但最大缺點(diǎn)是在開(kāi)放培

23、養(yǎng)或觀察時(shí)難以維持正常的pH值。造成pH波動(dòng)主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過(guò)程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問(wèn)題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開(kāi)放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時(shí)溢出培養(yǎng)瓶，再通過(guò)穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。 五、無(wú)毒、無(wú)污染 體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒(méi)有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）、無(wú)其他對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）。對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于取材過(guò)程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選

24、材，嚴(yán)格操作。對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于配制過(guò)程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過(guò)濾除菌。 第三節(jié) 天然細(xì)胞培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類(lèi)培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過(guò)程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類(lèi)物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。 一、血清(serum)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動(dòng)物血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在

25、動(dòng)物血清的應(yīng)用中牛血清又是最為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證血清質(zhì)量也是促進(jìn)生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。 1.血清種類(lèi):目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因：來(lái)源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解。牛血清對(duì)絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適。 牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時(shí)之

26、內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生1030天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。 2.血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制生長(zhǎng)活性是達(dá)到生理平衡的。對(duì)血清的成分和作用的研究雖有很大進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題。主要是： 第一:血清的成份可能有幾百種之多，目前對(duì)其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不

27、清楚，尤其是對(duì)其中一些多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子、激素和脂類(lèi)等尚未充分認(rèn)識(shí)，這給研究工作帶來(lái)許多困難； 第二:血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制； 第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一。 3.血清主要作用： 提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類(lèi)物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的物質(zhì)。 提供激素和各種生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類(lèi)固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等。 提供結(jié)合蛋白

28、：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用。 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。 對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來(lái)終止胰蛋白酶的消化作用。因?yàn)橐鹊鞍酌敢呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。 4.細(xì)胞培養(yǎng)中

29、使用血清的缺點(diǎn) 血清成分復(fù)雜，雖含許多對(duì)細(xì)胞有利成分，也含有對(duì)細(xì)胞有害的成分，使血清有幾個(gè)明顯的缺點(diǎn)： 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過(guò)程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長(zhǎng)（成纖維細(xì)胞）同時(shí)抑制另一類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)（表皮細(xì)胞）。 血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來(lái)自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡。 動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。 取材中可能帶入

30、支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性。 血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。 大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來(lái)源越來(lái)越困難，價(jià)格昂貴，是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)生產(chǎn)成本的主要部分之一。 5.血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對(duì)象，二是取材過(guò)程。用于取材的動(dòng)物應(yīng)健康無(wú)病并且在指定的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定。WHO公布的用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程中的要求： 牛血清必須來(lái)自有文件證明無(wú)牛海綿狀腦病的牛群或國(guó)家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。 有

31、些國(guó)家還要求牛血清來(lái)自未用過(guò)反芻動(dòng)物蛋白飼料的牛群。 證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。 血清要通過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，保證無(wú)菌。 無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國(guó)家要求無(wú)細(xì)菌噬菌體污染。 對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。 我國(guó)在對(duì)牛血清的質(zhì)量2000年版中國(guó)生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量，細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查。 血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個(gè)方面： 理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20

32、g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。 微生物檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對(duì)支原體、病毒的檢測(cè)，支原體是一種很小的微生物，可通過(guò)孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺(jué)，細(xì)胞也能生長(zhǎng)繁殖，但會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。 促生長(zhǎng)效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)檢測(cè)。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測(cè)定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。 (1)克隆形成率測(cè)定:一般以懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞為培養(yǎng)對(duì)象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)

33、，將不同批號(hào)的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細(xì)胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時(shí)間，統(tǒng)計(jì)有克隆生長(zhǎng)的孔，計(jì)算出百分比，再與對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)血清相比較，就可看出不同批號(hào)血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細(xì)微差別。 (2)貼瓶率測(cè)定:是以貼壁細(xì)胞為培養(yǎng)對(duì)象，將細(xì)胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個(gè)細(xì)胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計(jì)集落數(shù)，計(jì)算出集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比，同樣再與標(biāo)準(zhǔn)血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。 (3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細(xì)胞培養(yǎng)于3個(gè)一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測(cè)血清配制為5濃度，一般于第七天收集細(xì)胞，計(jì)

34、數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測(cè)試三個(gè)周期以上，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并將每次的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)血清的測(cè)試結(jié)果比較。 對(duì)于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無(wú)沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說(shuō)明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說(shuō)明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時(shí)感覺(jué)液體稀薄，說(shuō)明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。 6.血清的使用與儲(chǔ)存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用。 使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活

35、處理，即5630分鐘。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過(guò)滅活也會(huì)損失一些對(duì)細(xì)胞有利的成分，如生長(zhǎng)因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認(rèn)血清中不含補(bǔ)體成分。對(duì)于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。 儲(chǔ)存條件：血清一般儲(chǔ)存于20，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。購(gòu)買(mǎi)大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲(chǔ)存于20，使用前融化。融化時(shí)最好現(xiàn)置于4。融化后的血清在4不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，應(yīng)盡快使用。 使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為520，最常用是10。過(guò)多血清

36、容易使培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無(wú)限細(xì)胞系，迅速生長(zhǎng)之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 采購(gòu)血清時(shí)，最好先從供應(yīng)商處索取樣品進(jìn)行試驗(yàn)，選定一批后就要保留足夠使用6個(gè)月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過(guò)預(yù)先試驗(yàn)的樣品代替。 二、胚胎浸出液 胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。 三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細(xì)胞和原代細(xì)胞的培養(yǎng)。第四節(jié) 合成細(xì)胞培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工

37、設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達(dá)10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進(jìn)行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。 一、基本組分 基本培養(yǎng)基包括四大類(lèi)物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。 無(wú)機(jī)鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。 氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴(lài)、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型

38、)。它們都是細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類(lèi)轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)特別重要，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來(lái)源，還是合成磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4下放置1周可分解50%，使用中最好單獨(dú)配制，置-20冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。 維生素：是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，

39、對(duì)細(xì)胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補(bǔ)充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不可缺少的，對(duì)具有合成膠原能力的細(xì)胞更為重要。 碳水化合物：是細(xì)胞生命的能量來(lái)源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。 葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的產(chǎn)物。研究表明，體外培養(yǎng)條件下95的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，這降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蘋(píng)果酸

40、天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細(xì)胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應(yīng)生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進(jìn)行。另一個(gè)可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導(dǎo)致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過(guò)量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)最常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過(guò)低可造成細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。該方法需要對(duì)葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達(dá)量等參數(shù)進(jìn)行綜合考慮方

41、可應(yīng)用。 在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的主要能源，其能量代謝通路與體內(nèi)完全不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細(xì)胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過(guò)不完全氧化途徑，另一小部分通過(guò)完全氧化為細(xì)胞供能。因此，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，使之能促進(jìn)細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，同時(shí)減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。 許多動(dòng)物細(xì)胞如CHO、BHK和雜交瘤細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)而言，二者的快速利用并非細(xì)胞必需；相反相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細(xì)胞生長(zhǎng)

42、以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。 氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。 除了以上與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當(dāng)溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。 在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類(lèi))以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。 二、常用細(xì)胞培養(yǎng)基 (1).MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示） (2).DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示） (3)RPMI-1640細(xì)

43、胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示） (4).199細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示） (5).水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示） (6)歐氏平衡鹽（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示） (7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示） (8)其它類(lèi)型細(xì)胞培養(yǎng)基 三、干粉培養(yǎng)基的配制 配制培養(yǎng)基要注意以下問(wèn)題： 認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)都注明干粉不包含的成分，常見(jiàn)的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。 配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。 配制所用

44、的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。 所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。 配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于4度。 液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無(wú)菌的溶液，必要時(shí)可制成無(wú)內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。 配制方法 在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5的雙蒸水。 在室溫（20到30）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。 水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。 加NaHCO3到培養(yǎng)基中。 用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過(guò)分?jǐn)嚢琛?通過(guò)緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過(guò)濾時(shí)會(huì)上升0.1到0

45、.3，因 而調(diào)節(jié)pH值使它比最終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過(guò)濾前要保持密封。 第五節(jié) 無(wú)血清技術(shù)及其培養(yǎng)基 經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢(shì)。采用無(wú)血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。 無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿(mǎn)足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因

46、子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無(wú)血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。上海恒利安生物科技有限公司已成功開(kāi)發(fā)了商業(yè)化的多種無(wú)血清培養(yǎng)基，可滿(mǎn)足眾多廠商的需求。 一、無(wú)血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。 用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長(zhǎng)或兼性貼壁生長(zhǎng)；而當(dāng)其在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長(zhǎng)。 添加組分包

47、括以下幾大類(lèi)物質(zhì)： (1）促貼壁物質(zhì)：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長(zhǎng)，這種情況下無(wú)血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。 (2）促生長(zhǎng)因子及激素：針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長(zhǎng)因子。激素也是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素。 (3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無(wú)血清培

48、養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。 (4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：常見(jiàn)如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。 (5)微量元素：硒是最常見(jiàn)的。 二、使用方法:目前，血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后，再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無(wú)血清培養(yǎng)。在降低

49、過(guò)程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。 為了使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞： 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期 90% 活細(xì)胞率 適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種 有兩種方法使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）: 1. 直接適應(yīng)細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中。 一些類(lèi)型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng)，接種細(xì)

50、胞密度應(yīng)該:2.51053.5105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到11063106細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到21064106細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基。每隔35天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到11063106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。 2. 連續(xù)適應(yīng)分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。 以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。 當(dāng)細(xì)胞密度5105細(xì)胞/ml時(shí)，以2105到

51、3105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為5050的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。 以2106到3106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1106到3106細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。 每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1106到3106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。 建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。 在適應(yīng)過(guò)程中，最好不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性

52、。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。 細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基11（vv）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：12，14，116和100替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3次。 培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。 特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無(wú)血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器

53、經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o(wú)血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。 三、使用無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn) 增加確定性 性能更加一致 容易進(jìn)行純化和下游加工 細(xì)胞功能的精確評(píng)估 增強(qiáng)生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量 生理反應(yīng)性的較好對(duì)照 增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測(cè) 第六節(jié) 無(wú)蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基 一、無(wú)蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)來(lái)看，不含動(dòng)物

54、蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果再生長(zhǎng)過(guò)程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過(guò)程就比較復(fù)雜，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無(wú)蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢(shì)而出現(xiàn)的，許多無(wú)蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長(zhǎng)因子的作用。市場(chǎng)上已有適合多種細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)蛋白培養(yǎng)基。 二、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動(dòng)物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌

55、產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的CDM問(wèn)世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。 第七節(jié) 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，除了培養(yǎng)基外，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調(diào)整液等。 一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）:主要是由無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)。主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。最簡(jiǎn)單的BSS是Ringer。D-Hanks與Hanks的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液

56、。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件，Hanks平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應(yīng)注意。 配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過(guò)濾除菌或高溫滅菌。 二、消化液:取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時(shí)也用膠原酶（collagenase）溶液。 1.胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的

57、能力表示，常見(jiàn)有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hanks），因?yàn)檫@些物質(zhì)會(huì)對(duì)胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過(guò)濾除菌。過(guò)濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。 使用細(xì)胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細(xì)胞清洗液（100ml細(xì)胞清洗液加0.5g胰酶），過(guò)濾除菌，分裝于4度保存。 2.EDTA溶液：EDTA溶液也常用來(lái)解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制后可過(guò)濾除菌，也可高溫消毒滅菌。 3.膠原酶溶液：膠原酶在上皮類(lèi)細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或U/L,作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用PB