1、實時熒光定量PCR技術(shù)簡介,應(yīng)用工程師 張曉輝,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 OUTLINE,實時熒光定量PCR原理 熒光定量PCR儀簡介 實時熒光定量PCR在科研上的應(yīng)用 實時熒光定量PCR實驗設(shè)計實例,實時熒光定量PCR原理 OUTLINE,實時熒光定量PCR的原理： 什么是實時熒光定量PCR 熒光化學(xué) 雙通道與內(nèi)標 基因分型（SNP）檢測,實時熒光定量PCR原理,常規(guī)PCR技術(shù)： PCR后借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行定量及定性分析,常規(guī)PCR,實時熒光定量PCR原理 常規(guī)PCR,常規(guī)PCR結(jié)合電泳分析方法的缺點,只能對終產(chǎn)物進行分析,無法對起始模板準確定量 必須在擴增反應(yīng)結(jié)束后借助

2、電泳方法分析,費時費事 無法對擴增反應(yīng)實時檢測 EB有毒,Opticon,實時熒光定量PCR原理,定量PCR技術(shù)： 利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析,定量PCR,實時熒光定量PCR原理,實時熒光定量PCR三個關(guān)鍵詞： 實時，熒光，定量 如何實時檢測？ 借助熒光物質(zhì)示蹤擴增產(chǎn)物量的變化,定量PCR,實時熒光定量PCR原理,在PCR反應(yīng)加入能示蹤擴增產(chǎn)物的熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，得到一條熒光擴增曲線圖，從而通過熒光強度變化實時監(jiān)

3、測產(chǎn)物量的變化,熒光曲線,如何對起始模板定量？ 通過Ct值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析 引入兩個概念： 熒光閾值、Ct值,實時熒光定量PCR原理 定量原理,熒光閾值 在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個熒光強度標準(即PCR擴增產(chǎn)物量的標準),實時熒光定量PCR原理 定量原理,實時熒光定量PCR原理 定量原理,Ct值的概念 Ct值的定義是PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物(熒光信號）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù),Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系 初始 模板量越多, 擴增產(chǎn)物達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少,確定初始模板的濃度,實時熒光定量PCR原理 定量原理,實時熒光定量PCR原理 定量原理,理

4、想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n 非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率,定量原理,實時熒光定量PCR原理,在擴增產(chǎn)物達到閾值線時: XCt=X0 (1+Ex)Ct =N (1) XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為N. 方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得: log N=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達 到域值的循

5、環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量,定量原理：利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品作出標準曲線,通過未知樣品的Ct值,從標準曲線上計算出該樣品的起始濃度。,如何定量,熒光強度-循環(huán)數(shù)曲線,初始模板量對數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標準曲線,.,未知,104,103,106,105,102,10,實時熒光定量PCR原理,Determine C(t) value for unknown Interpolate quantity of unknown using the standard curve,Unknown contains 3108 copies,實時熒光定量PCR原理,實時熒光定量PCR原理,閾值的選擇 熒光

6、閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,實時熒光定量PCR原理,為什么要用Ct值定量 實時熒光定量PCR方法利用Ct的概念，在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。,實時熒光定量PCR原理,相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴增的擴增曲線圖終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性,Ct值的重現(xiàn)性,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 與傳統(tǒng)PCR的比較,Absolute quantification is possible

7、Sensitive Detects lower copies of target Detects small fold differences Samples with a broad range of concentrations are analyzed without normalizing concentration Cost effective and time efficient Flexible assay design,實時熒光定量PCR原理 OUTLINE,實時熒光定量PCR的原理： 什么是實時熒光定量PCR 熒光化學(xué) 雙通道與內(nèi)標 基因分型（SNP）檢測,實時熒光定量PCR

8、原理,示蹤擴增產(chǎn)物量變化的熒光物質(zhì)及其工作原理,SYBR Green 1,Molecular Beacons,TaqMan,熒光化學(xué),MJR系列實時熒光定量PCR儀之,SYBR Green I,SYBR Green 1,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,SYBR Green I 工作原理,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。,Bound SYBR Green I,Unbound SYBR Green I,PCR,SYBR Green I fluorescence increases

9、 upon binding dsDNA Post-amplification melting curve analysis,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 工作原理,SYBR Green I 工作原理,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,SYBR Green I 優(yōu)點,使用方便 - 不必設(shè)計復(fù)雜的熒光探針 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,SYBR Green I 缺點,與非特異性產(chǎn)物結(jié)合,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,Graph fluorescence intensity vs. temperature De

10、creasing fluorescence recorded Due to increasing temperature Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curve,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 融解曲線分析,Plot the negative of the rate of change of fluorescence vs. temperature (-dI/dT),MJR系列實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 融

11、解曲線分析,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 融解曲線分析,Identical reaction components, except initial template concentration varies,Amplification results,1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. 63oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. Plate Read 6. 84oC for 1 sec 7. Plate Read 8. Go to line 2 39 more times 9. Melt

12、ing curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 融解曲線分析,Amplification results,1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. 63oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. Plate Read 6. 84oC for 1 sec 7. Plate Read 8. Go to line 2 39 more times 9. Melting curve from 65oC to

13、95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 融解曲線分析,For reliable nucleic acid quantification, each primer set requires individual optimization Parameters used to optimize reaction specificity and efficiency Primer design Amplicon design Concentration of reagents Cycling conditio

14、ns Denaturation and annealing temperatures,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 Real-time PCR體系優(yōu)化,Dynamic thermal gradient allows for one-step reaction-temperature optimization Up to 24oC gradient range,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 Real-time PCR體系優(yōu)化,Melting curve results,Amplification results,1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec

15、3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. 83oC for 1 sec 6. Plate Read 7. Go to line 2 39 more times 8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 Real-time PCR體系優(yōu)化,SYBR Green I 應(yīng)用范圍,起始模板濃度定量 融解曲線分析 -可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體 基因型分析,MJR系列實時熒光定

16、量PCR儀之,Molecular Beacons,Molecular Beacons,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,發(fā)夾型雜交探針,Molecular Beacons,原理：熒光諧振能量傳遞（FRET）,莖由互補配對的序列組成,環(huán)與目標序列完全配對,莖,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,熒光素,淬滅劑,環(huán),變性: 產(chǎn)生非特異性的熒光,Molecular Beacons,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,Target-loop interaction more stable than stem-stem,T,A,C,C,G,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,

17、T,T,T,T,T,G,C,C,C,C,C,A,A,A,A,Q,R,Target,During the annealing step: Probe binds target Reporter and quencher separated Target-specific fluorescence,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons,延伸: 沒有熒光,Molecular Beacons SNP,Opticon實時熒光定量PCR儀之,Molecular Beacons 實驗結(jié)果,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 Molecular

18、Beacons實驗程序,1. 94 5 min 2. 95 5 sec 3. 58 30 sec 4. Plate read 5. 72 30 sec 6. Goto step 2 for more 39 times,Molecular Beacons 應(yīng)用范圍,定量起始模板濃度 基因型分析 鑒定產(chǎn)物 單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,Molecular Beacons SNP,T,A,C,C,G,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,T,T,T,T,G,C,C,C,C,C,A,A,A,A,Q,熒光素,目標序列,莖,淬滅劑,MJR

19、系列實時熒光定量PCR儀之,Molecular Beacons 優(yōu)點,對目標序列有很高的特異性 用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一 熒光背景低,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,Molecular Beacons 缺點,設(shè)計困難 無終點分析功能 只能用于一個特定的目標 價格較高,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,TaqMan,探針,熒光素,淬滅劑,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,TaqMan,水解型雜交探針,TaqMan,目標特異性探針 5 為熒光素， 3 為淬滅劑,5 熒光素,3淬滅劑,與目標序列互補,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,Intact probe - reporter quen

20、ched by FRET,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 TaqMan 工作原理,TaqMan 實驗結(jié)果,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 TaqMan實驗程序,1. 94 5 min 2. 95 5 sec 3. 58 30 sec 4. Plate read 5. Goto step 2 for more 39 times 6. end,TaqMan 應(yīng)用范圍,定量起始模板濃度 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP分析,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,TaqMan 優(yōu)點,對目標序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測 與 Molecular Beacons

21、相比設(shè)計相 對簡單,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,TaqMan 缺點,價格較高 只適合于一個特定的目標 不能進行融解曲線分析 背景高,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,兼容化學(xué)試劑總結(jié),MJR系列實時熒光定量PCR儀之,實時熒光定量PCR原理 OUTLINE,實時熒光定量PCR的原理： 什么是實時熒光定量PCR 熒光化學(xué) 雙通道與內(nèi)標 基因分型（SNP）檢測,MJR系列實時熒光定量PCR儀之,雙通道與內(nèi)標,準確的相對定量方法-內(nèi)標法 -解決模板提取過程中造成的差別 -解決樣品材料不均一造成的差別 -解決加樣過程中的差別,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 內(nèi)標法,內(nèi)標法必須：在一個PCR管中

22、進行兩種PCR反應(yīng)： 一個是有差別的（目標RNA或DNA） 一個是無差別的（內(nèi)標RNA或DNA）,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 內(nèi)標法,內(nèi)標的種類 看家基因 添加DNA或RNA,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù),多色雙通道技術(shù)： 多色：可使用多種熒光染料 雙通道：可同時測定兩種熒光染料 發(fā)出的熒光,一個PCR管內(nèi)進行兩種PCR擴增要解決的問題： 1、引物及探針問題-引物及探針的相 互干擾 2、模板量差別-共用資源的相互競爭,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù),F,R,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù),1、引物及探針問題,2、共用資 源的相互競爭,實時熒光定量PCR技術(shù)

23、之 多色雙通道技術(shù),F,R,F,R,R,Q,解決辦法：單雙通道同時進行，相互驗證,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù),單,單,雙,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù),解決辦法之二：primer limiting,實時熒光定量PCR原理 OUTLINE,實時熒光定量PCR的原理： 什么是實時熒光定量PCR 熒光化學(xué) 雙通道與內(nèi)標 基因分型（SNP）檢測,F,R,C,SNP G/A,Forward primer,Reverse primer,Allele-specific probe,Allele-specific probe,用TaqMan探針進行基因型分析,實時熒光定量PCR技術(shù)之

24、 SNP檢測-基因型分析,Q,5,3,G,Hybridization of TaqMan Probe,Digestion of probe - fluorescence,NO digestion of probe - NO fluorescence,Match for Allele 1,Reduced Efficiency of Probe Hybridization,Mismatch for Allele 1,Polymerase,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析,從病人血液樣品中提取 DNA 基因型分類： A/A (Allele 1) G/G (Allele 2)

25、G/A (Heterozygote),實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析,Allele 1 control,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析,Allele 2 control,VIC,FAM,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析,Heterozygote control,FAM,VIC,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析,實時熒光定量PCR技術(shù)之 多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析,實時熒光定量PCR技術(shù)之 SNP網(wǎng)站,SNP的網(wǎng)站 dbSNP(http

26、://SNP/):該網(wǎng)站是由美國的NCBI主辦的。它除了可接受各地發(fā)來的SNP申請注冊外，也向公眾免費提供對SNP的查詢。 (2) HGBASE(eractiva.de):該網(wǎng)站建在德國，收集基因內(nèi)SNP，研究者可通過檢測出的序列查詢SNP。 (3) MIT SNP數(shù)據(jù)庫(/SNP/human/index.html):該網(wǎng)站是由美國麻省理工學(xué)院建立的。它包括數(shù)千條已經(jīng)定位的SNP，可以通過指定染色體的某一區(qū)域查詢SNP。,其它的SNP站點還有：華盛頓大學(xué)，網(wǎng)址是：http

27、://SNP; CHLC,網(wǎng)址是：/cgap/nature-genetics-snps.html; 美國人類基因組研究所，網(wǎng)址是：/About-NHGRI/Der/variat.htm。,實時熒光定量PCR技術(shù)之 SNP網(wǎng)站,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 OUTLINE,實時熒光定量PCR原理 熒光定量PCR儀簡介 實時熒光定量PCR在科研上的應(yīng)用 實時熒光定量PCR實驗設(shè)計實例,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 外觀圖片,生產(chǎn)商：美國MJ Research

28、公司,Chromo4 Four-Color Real-Time Detector,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 組成介紹,循環(huán)儀 檢測系統(tǒng) 計算機及軟件系統(tǒng),Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 循環(huán)儀溫控系統(tǒng),PTC200 加熱:電熱絲+ 半導(dǎo)體 制冷:半導(dǎo)體,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 循環(huán)儀構(gòu)造,Chromo 4的PCR儀結(jié)構(gòu)： 三傳感器 雙區(qū)域溫度 -溫度梯度,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 檢測系統(tǒng),檢測,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 光源-LED,優(yōu)勢 壽命長 穩(wěn)定 體積小 產(chǎn)熱少 可過夜運

29、行,發(fā)光二極管（LED）,優(yōu)勢 靈敏 檢測范圍廣 體積小 耐用,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之光電二極管（PDT）,光電二極管通過吸收光子產(chǎn)生電流,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu),多色四通道 四組LED、濾鏡和PDT 組成光學(xué)檢測模塊 4個LED依次發(fā)光，消除 孔間干擾 檢測模式為掃描型， 11 秒掃過96個樣品 掃描頭離樣品距離近， 提高檢測的靈敏度。,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 四通道檢測,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 四通道檢測,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 寬廣的線性范圍,用

30、VIC標記的-actin連續(xù)10倍稀釋標準品定量結(jié)果,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 高分辨率,可以清晰的分辨出128、256、512、1024拷貝數(shù)的初始模板量,Chromo 4四通道實時熒光定量基因檢測系統(tǒng)之 優(yōu)越的重復(fù)性,無論使用哪一個通道，無論使用非特異性的SG1 或特異性的TaqMan 探針，都能得到重復(fù)性極好的結(jié)果,Opticon 實時熒光定量PCR儀之 實驗結(jié)果（1）,實驗時間： 2002年8月16日 地點： 北京紅十字血液中心 試劑： PG公司 HIV及HCV試劑盒 樣本： 血液中心-20度保存,Opticon 實時熒光定量PCR儀之 實驗結(jié)果（2）,實驗時間

31、： 2002年8月14日 地點： 北京紅十字血液中心 試劑： PG公司 HIV試劑盒 樣本： 血液中心-20度保存,Opticon 實時熒光定量PCR儀之 實驗結(jié)果（3）,實驗時間： 2002年8月21日 地點： 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 試劑： PG公司 HBV試劑盒 樣本： 參控標準品,Opticon 實時熒光定量PCR儀之 SARS試劑盒實驗結(jié)果,Opticon 實時熒光定量PCR儀之 實驗結(jié)果（ERBB2檢測）,Opticon 2 實時熒光定量PCR儀之 實驗結(jié)果（雙色分析）,Opticon 2 實時熒光定量PCR儀之 實驗結(jié)果（線性范圍）,Opticon 2 實時熒光定量PCR儀之 實驗

32、結(jié)果（線性范圍與重復(fù)性）,Opticon 2 實時熒光定量PCR儀之 實驗結(jié)果（2倍分辨率）,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 OUTLINE,實時熒光定量PCR原理 熒光定量PCR儀簡介 實時熒光定量PCR在科研上的應(yīng)用 實時熒光定量PCR實驗設(shè)計實例,實時熒光定量PCR技術(shù)之 應(yīng)用,定量： DNA定量 RNA定量 定性： SNP分析 基因型分析 RNA變異分析 融解曲線分析,臨床定量研究的應(yīng)用： 病原微生物引起的疾病的檢測 病原微生物含量與病情的輕重程度、傳染性及治療效果之間的關(guān)系 新的治療與預(yù)后指標的研究 病原微生物含量與用藥之間的關(guān)系 新的病原體分子診斷標準 超早期感染治療用藥物及療法

33、的研究與開發(fā) 在傳染病流行病學(xué)方面的應(yīng)用 ：醫(yī)院血站防疫站,實時熒光定量PCR技術(shù)之 應(yīng)用,8. 傳染病的發(fā)病監(jiān)控、預(yù)測與預(yù)防 9. mRNA的表達水平與是否腫瘤及其進展的關(guān)系 10.腫瘤相關(guān)基因表、腫瘤標志物 和腫瘤耐藥基因的檢測 11. mRNA的表達水平與染病及病情之間的關(guān)系：預(yù)測 、診斷、評價、指導(dǎo)治療,實時熒光定量PCR技術(shù)之 應(yīng)用,實時熒光定量PCR技術(shù)之 應(yīng)用,臨床定性檢測(SNP)的應(yīng)用： 1.等位基因與遺傳病之間的關(guān)系 2.診斷及預(yù)測致病風(fēng)險 3. SNP與體質(zhì)遺傳病之間的關(guān)系 4.藥物基因組學(xué)及新藥的發(fā)現(xiàn) 5.合理用藥研究,其他： 比較染病組織與正常組織中各種mRNA含量差

34、異 病毒性疾病中病毒的耐藥性變異株的測定HBV基因突變，尤其是前核基因突變，直接影響HBV感染病情轉(zhuǎn)歸及抗毒治療效果，同時也反映了來自體內(nèi)或外界選擇壓力的作用。因此，突變株在體內(nèi)產(chǎn)生的確切原因，突變株與野生株混合存在的發(fā)展趨向，突變株是否為耐藥株，突變株與野生株相對含量的變化與致病性的關(guān)系，突變株與免疫耐受的關(guān)系等均是有必要進一步澄清的問題。 新臨床診斷及檢驗試劑的開發(fā) 研究ELISA方法的漏檢率 HLA分型：取代傳統(tǒng)電泳方法,實時熒光定量PCR技術(shù)之 應(yīng)用,實時熒光定量PCR技術(shù)之 應(yīng)用,6. 遺傳病診斷 ：如地中海貧血 等位基因檢測 多基因遺傳病的突變檢測 基因表達異常所致遺傳病檢測 胚胎

35、植入前遺傳診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是用人類輔助生殖技術(shù)獲得受精卵，體外培養(yǎng)發(fā)育到610細胞的卵裂球時，通過顯微操作技術(shù)從中活檢12個單細胞，利用醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)對單個卵裂球細胞標本進行遺傳診斷，然后將它們移植回母體子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育至妊娠，從而避免遺傳病患兒出生。遺傳病基因攜帶夫婦如不想用產(chǎn)前診斷、人工流產(chǎn)來避免高危受累患兒的出生，PGD目前是他們的唯一選擇。與以前采用的巢式PCR相比，F(xiàn)QPCR減少了等位基因缺失（allele drop-out，ADO）現(xiàn)象的發(fā)生。,MJR系列 實時熒光定量PCR儀之 應(yīng)用,其他方面的部分應(yīng)用： 公

36、安系統(tǒng)相關(guān) ： 個人身份鑒定 物證的各種鑒定 人種的鑒定 考古方面 動植物檢疫,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 應(yīng)用,研究方面部分應(yīng)用 基因表達分析： responses to a particular stimulus tissue differentiation stages of development cell proliferation disease state progression,物種分類 環(huán)境污染與毒理監(jiān)測：生物標志物的定量檢測 基因芯片結(jié)果的復(fù)證 分子生態(tài)學(xué)研究 Genotyping,MJR系列 實時熒光定量PCR儀之 應(yīng)用,MJR系列 實時熒光定量PCR儀之 應(yīng)用,轉(zhuǎn)

37、基因研究方面的部分應(yīng)用： 轉(zhuǎn)基因的基因拷貝數(shù)與受體生物性狀之間的關(guān)系； 轉(zhuǎn)基因的基因表達量與受體生物性狀之間的關(guān)系； 轉(zhuǎn)基因胚胎中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的測定； 轉(zhuǎn)基因?qū)κ荏w生物其他基因表達的影響（包括不同的發(fā)育時期的影響）；,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 應(yīng)用,轉(zhuǎn)基因生物安全方面的部分研究： 轉(zhuǎn)基因在環(huán)境中的擴散監(jiān)測； 轉(zhuǎn)基因生物世代傳遞中的拷貝數(shù)、表達量變化監(jiān)測 食品、煙草、化妝品等中轉(zhuǎn)基因成份含量的測定 （GMO) 轉(zhuǎn)基因成分含量與毒理代謝之間的關(guān)系,MJR系列實時熒光定量PCR儀之 OUTLINE,實時熒光定量PCR原理 熒光定量PCR儀簡介 實時熒光定量PCR在科研上的應(yīng)用 實時熒光定量P

38、CR實驗設(shè)計實例,應(yīng)用實例之 Outline,Two-color-real-time qPCR assay for Cancer marker expression using TaqMan probes One-color real-time qPCR assay(SGI) for GMO soy detection One-color real-time qPCR assay (SGI) for tissue profiling Experiment setting and data analysis,Traditional Northern blot Useful for mRNA si

39、ze determination RNase protection assay Mapping initiation, termination and alternative splice sites High throughput Microarrays,應(yīng)用實例之 基因表達的研究方法,Absolute quantification Sensitive Detects lower copies of target than other methods Detects small fold differences Samples with a broad range of concentrat

40、ions are analyzed without normalizing concentration Cost effective and time efficient Ease of use,應(yīng)用實例之 RT-qPCR的優(yōu)點,應(yīng)用實例之 Cancer marker expression,TaqMan chemistry Multiplexing Expression differences of ERBB2 in neoplastic breast tissue samples,應(yīng)用實例之 Cancer marker expression,ERBB2 oncogene Transmembr

41、ane tyrosine kinase overexpressed in 25 % of breast cancer cases Increased transcript levels associated with a poor prognosis and lower response to standard treatments GAPDH housekeeping gene for normalization,材料和方法 材料,從 正常乳腺組織中提取的 Total RNA 從乳腺癌組織中提取的 Total RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的質(zhì)粒用于生成標準曲線 單雙通道同時進

42、行，獨立分析 Controls no RNA RNA + no reverse transcriptase,實驗材料,材料和方法 RT-qPCR,材料和方法 RT-PCR,RT-qPCR program 1,50C,30min 2,95C,15min 3,94C,15sec 4,60C,1min 5,plate read 6,go to step 3,39 more times 7,10C,forever End,應(yīng)用實例之 Cancer marker expression,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for

43、ERBB2,CH1-FAM detection- ERBB2,實驗結(jié)果 擴增曲線,CH2-VIC detection- GAPDH,實驗結(jié)果 單雙通道相互驗證,ERBB2單雙通道相互驗證的實驗結(jié)果,Healthy RNA,Tumor RNA,GAPDH,ERBB2,1095 1052,2130 2492,95500 85730,136000 130800,2.16 X,1.45 X,Copies ng/ l Total RNA,實驗結(jié)果 定量,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/1

44、36000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,實驗結(jié)果 定量分析,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,1.2,1.4,1.6,1.8,2,Healthy Tissue,Carc. Tissue,Relative Expression,ERBB2的表達差異,實驗結(jié)果 表達差異,討論 成功檢測,利用RT-qPCR在Opticon2上成功檢測了ERBB2基因在不同組織的 表達差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達量提高到正常水平的1.8倍,應(yīng)用實例之 實驗設(shè)計

45、中的常見問題,用于生成標準曲線的樣品如何設(shè)定？ 含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒 含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA 紫外分光光度計或熒光酶標測定濃度 根據(jù)質(zhì)粒或cDNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋,Opticon 實時熒光定量PCR儀之 部分發(fā)表文獻,Opticon Reference Papers L. Shively, L.Chang, J.M. LeBon, Q.Liu. A.D. Riggs, and J. Singer-Sam. Real-Time PCR Assay for Quantitative Mismatch Detection. BioTechniques, M

46、arch 2003, Vol. 34, No. 3. (Mismatch detection) F. Grun, R. N. Vankatesan, M. M. Tabb, C. Zhou, J. Cao, D. Hemmati, B. Blumberg. Benzoate X Receptors a and Are Pharmacologically Distinct and Do Not Function as Xenobiotic Receptors. The Journal of Biological Chemistry. Issue of November 15, Volume 27

47、7, No.46, pp. 43691-43697, 2002. (RT-PCR, SYBR Green) K. Decker, T. Trager, A. Missel, K. Heitz, S. Kobsch, K. Machura, D. Loffert. Optimizing Probe Hybridization in Real-Time PCR for Quantification and SNP Genotyping. Qiagen News, Issue 4, pp. 13-16, 2002. (SNP Genotyping) N. Qi, L. Kazdova, V. Zid

48、ek, V. Landa, V. Kren, H. A. Pershadsingh, E. St. Lezin, N. A. Abumrad, M. Pravenac, T. W. Kurtz. Pharmacogenetic Evidence That Cd36 Is a Key Determinant of the Metabolic Effects of Pioglitazone. The Journal of Biological Chemistry. Issue of December 13, Volume 277, No. 50, pp. 48501-48507, 2002. (G

49、ene Expression),Opticon 實時熒光定量PCR儀之 部分發(fā)表文獻,L. Wu, Y. Wu, B. Gathings, M. Wan, X. Li, W. Grizzle, Z. Liu, C. Lu, Z. Mao, x. Cao. Smad4 As A Transcription Corepressor for Estrogen Receptor a . JBC Papers In Press, Published on February7, 2003 as Manuscript M212332200. (Chromatin PPT.) 6. L. Qin, P. Qiu, L. Wang, X. Li, J. T. Swarthout, P. Soteropoulos, N. C. Partridge. Gene Expression Profiles and Transcription Factors Involved in PTH Signalling in Osteoblasts Revealed by MicroArray and BioInformatics. JBC Papers in Press. Publ