1、實用免疫細胞與核酸 課件模板-108,實用免疫細胞與核酸：參考文獻,參考文獻：,1。Drake JW, etal.Updating the theory of mutation. American Scientist, 1983; 71:621 2.Jukes TH, et al. Evolutionarynucleotide replacements in DNA.Nature, 1979;281:605 3.趙壽元.自然科學年鑒.上海翻譯出版公司，1987 4。,實用免疫細胞與核酸：參考文獻,參考文獻：,Maniatis T, etal. Moleculer cloning: A labo

2、ratory Manual. Cold Sping Harbor Laboratory, 1982 5.Myers RM, et al. Dctection ofsingle base substitutions by ribonuclease cleavage at mismatches in RNA:DNAduplexes. Sicence, 1985;230:1242 6.Mullis K, et al. Specificenzymatic amplificaton of DNAin vitro. The polymerase chain reaction. ColdSpring Har

3、bor Symposia on Qantitative Biol,1986; L1:263 7.金冬雁，等譯.分子克隆實驗指南.北京:科學出版社,1992 8.孫乃恩,等編著.分子遺傳學.南京:南京大學出版社,1993 9.邱澤生,主編.基因工程.北京:首都師范大學出版社,1992 10.張昌穎,主編.核酸生物化學.北京:人民衛(wèi)生出版社,1993 11.杜傳書,劉祖洞,主編.醫(yī)學遺傳學.第二版,北京:人民衛(wèi)生出版社,1992。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質(zhì)為水溶性，在用于免疫細胞化學研究之前，常需固定。但肽類和蛋白質(zhì)的物理、化學性質(zhì)不同，因而對不同的固

4、定方法或固定劑的反應也不盡相同。某些固定劑甚至可同時破壞和/或保護同一抗原的不同抗原決定簇。因此，在進行免疫細胞化學研究之前，很有必要了解所要研究的物質(zhì)（蛋白質(zhì)或肽類）的化學性質(zhì)，并根據(jù)需要來選擇適宜的固定劑（或固定方法）以及改進固定條件。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,目前，免疫細胞化學研究中常用的固定劑仍為醛類固定劑，其中以甲醛類和戊二醛最為常用。在此，簡要介紹幾種目前較為常用和推薦的固定劑，以供讀者選用。 1. 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.3） 試劑：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸緩沖液至1000ml 配制方法：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶

5、中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer以下簡稱PB），加熱至60左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮，最后補足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混勻。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,該固定劑較適于光鏡免疫細胞化學研究，最好是動物經(jīng)灌注固定取材后，繼續(xù)浸泡固定224h。另外，該固定劑較為溫和，適于組織標本的較長期保存。 2. 4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉 試劑：A液：多聚甲醛40g 蒸餾水400ml B液：Na2HPO42H2O16.88g 蒸餾水300ml C液：Na

6、OH3.86g 蒸餾水200m 配制方法：A液最好在500ml的三角燒瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,注意，在溶解多聚甲醛時，要盡量避免吸入氣體或濺入眼內(nèi)。B液和C液配制好后，將B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1nNaOH或1N HCl 將pH調(diào)至7.27.4，最后，補充蒸餾水至1000ml充分混合，4冰箱保存?zhèn)溆谩?該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細胞化學研究，用于免疫電鏡時，最好加入少量新鮮配制的戊二醛，使其終濃度為0.5%1%。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,該固定劑較溫和，適于組織的長期保存。組織標本于該

7、固定液中，4冰箱保存數(shù)月仍可獲得滿意的染色效果。 3。 Bouins液及改良Bouins液 試劑：飽和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先將飽苦味酸過濾，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4冰箱中備用。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,冰醋酸最好在臨用前加入。改良Bouins液即不加冰醋酸。 該固定液為組織學、病理學常用固定劑這一，對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整。但因偏酸（pH為33.5），對抗原有一定損害，且組織收縮較明顯，故不適于組織標本的長期保存。此外，操作時，應避免吸入或與皮膚接觸。 4。Zambonis(Stefanini

8、s)液 試劑：多聚甲醛20g 飽和苦味酸 150ml Karasson-Schwlts PB至1000ml 配制方法：稱取多聚甲醛20g，加入飽和苦味酸150ml，加熱至60左右，持續(xù)攪拌使充分溶解、過濾、冷卻后，加Karasson-Schwlts PB至1000ml充分混合（Karasson Schwlts磷酸緩沖液的配制配制方法見后）。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,該固定液適于電鏡免疫細胞化學，對超微結構的保存較純甲醛為優(yōu)，也適于光鏡免疫細胞化學研究，為實驗室常用固定劑之一。我們在應用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的飽和苦味酸，以增加其對組織的穿透力和固定效果，保存

9、更多的組織抗原。固定時間為618h。 5。PLP液PLP液即過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-aldehyde fixative） 試劑：過碘酸鈉 賴氨酸鹽酸鹽（或鹽酸賴氨酸）： 多聚甲醛 蒸餾水 配制方法： （1）貯存液A（0.1mol/L賴氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：稱取賴氨酸鹽酸鹽1.827g溶于50ml蒸餾水中，得0.2mol/L的賴氨酸鹽酸鹽溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，將pH調(diào)至7.4，補足0.1mol/L的PB至100ml，使賴氨酸濃度也為0.1mol/L,4冰箱保存，最好兩周內(nèi)使用。,

10、實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,此溶液的滲透濃度為300mOs mmol/L/kg。 （2）貯存液B（8%多聚甲醛溶液）：稱8g多聚甲醛加入100ml蒸餾水中，配成8%多聚甲醛液（方法見前）。過濾后4冰箱保存。 （3）臨用前，以3份A液與1份B液混合，再加入結晶過碘酸鈉（NaIO4），使NaIO4終濃度為2%。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,由于AB兩液混合，pH從約7.5降至6.2，故固定時不需再調(diào)pH值。固定時間為618h。 該固定劑較適于富含糖類的組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。其機制是借助于過碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過賴氨酸的雙價氨基與

11、醛基結合，從而與糖形成交聯(lián)。由于組織抗原絕大多數(shù)都是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構成，抗原決定簇位于蛋白部分，故該固定劑有選擇性地使糖類固定，這樣既穩(wěn)定了抗原，又不影響其在組織中的位置關系。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,Mclean和Nakane等認為，最佳的混合是：含0.01mol/L的過碘酸鹽、0.075mol/L的賴氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸緩沖液。 6。Karnovskys液（pH7.3） 試劑：多聚甲醛30g 25%戊二醛80ml 0.1mol/L PB至1000ml 配制方法：先將多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/

12、L的PB至1000ml，混勻。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,該固定劑適于電鏡免疫細胞化學，用該固定液在4短時固定，比在較低濃度的戊二醛中長時間固定能更好地保存組織的抗原性和細微結構。固定時最好先灌注固定，接著浸泡固定1030min，用緩沖液漂洗后即可樹酯包埋或經(jīng)蔗糖溶液后用于恒冷切片。 7。0.4% 對苯醌 （Parabenzoquinone） 試劑：對苯醌4.0g 0。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,01mol/L PBS1000ml 配制方法：稱取4.0g對苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。 對苯醌對抗原具有較好的保護作用，但對超微結構的

13、保存有一定影響，故常與醛類固定劑混合使用。一般要求臨用前配制，且避免加熱助溶，因加熱或放置時間過長，固定液變?yōu)樽厣梁稚瑫菇M織標本背景增加，影響觀察。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,此外，對苯醌有劇毒，使用時避免吸入或與皮膚接觸。 8。PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehydefixative, PFG） 試劑：對苯醌20g 多聚甲醛15g 25%戊二醛40ml 0.1mol/L二甲酸鈉緩沖液至1000ml 配制方法：先以500ml左右的二甲酸鈉緩沖液溶解對苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸鈉緩沖液至100

14、0ml充分混合。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,對苯醌與戊二醛及甲醛聯(lián)合應用，即可阻止醛基對抗原的損害，又不影響超微結構的保存，故適于多種類抗原的免疫細胞化學，尤其是免疫電鏡的研究。 9。碳二亞酰胺-戊二醛（ECD-G）液 試劑：0.05mol/L PB500ml 0.01mol/L PBS 500ml Tris約14g 濃HCl 少許 ECD 10g 25%戊二醛3.5ml 配制方法：先以約500ml的PB與相同體積的PBS混合，加入Tris（使其終濃度為1.4%）溶解，以濃HCl調(diào)pH至7.0，再將事先稱取好的ECD和戊二醛加入混合液，振搖后計時，用pH計檢測，約23min

15、時，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min內(nèi)調(diào)pH至7.0，此時，將該混合固定液加入盛有細胞（經(jīng)PBS漂洗過）的器皿中，在23固定7min后，以PBS洗去固定液，即可進一步處理。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboiimidehydrochloride，簡稱乙基-CDI，常用于多肽類激素的固定，對酶等蛋白質(zhì)的固定也有良好效果。ECD單獨應用時，邊緣固定效應重，但與戊二醛、Tris及PB聯(lián)合應用，效果明顯改善，細胞質(zhì)仍可滲透，利用細胞中抗原的定位，超微結構保存較好

16、。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,目前認為是一種用于培養(yǎng)細胞電鏡水平免疫細胞化學研究的很好的固定劑。 10。四氧化鋨（鋨酸Osmic Acid, OsO4） 配制：將洗凈裝有OsO4的安瓿中加熱后，迅速投入裝有溶劑的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用鉆石刀在安瓿上劃痕，洗凈后再放入瓶中，蓋好瓶塞，用力撞擊安瓿，待其破后加溶劑稀釋。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,為保證充分溶解，應在用前幾天配制。 （1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作為儲備液，于冰箱中密封保存。 （2）1% OsO4-PB： 試劑：A、2.26%NaH2PO42H2O4.

17、15ml B2.52%8.5ml C、5.4%葡萄糖5ml D、OsO40.5g 配制方法：先分別配好A、B、C三種液體，取A液41.5ml與B液8.5ml混合，將pH調(diào)至7.37.4，取AB混合液45ml再與5ml C液混合即為0.12mol/L PBG。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,（3）1%OsO4/0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.27.4）： 試劑：2% OsO4水溶液10ml 0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.27.4）10ml 配制方法：取2%OsO4儲備液10ml與等量0.2mol/L、pH7.27.4的二甲胂酸鈉緩沖液充分混合即可。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,OsO4是電鏡研究所必需的試劑，常用于后固定。盡管OsO4主要為脂類固定劑，但也可與肽類及蛋白質(zhì)起作用，形成肽-蛋白質(zhì)或肽-脂交聯(lián)。過氧化物酶的反應產(chǎn)物經(jīng)OsO4處理后，電子密度增高，適于電鏡研究。但由于OsO4的反應產(chǎn)物對光及電子有較明顯的吸收能力，因此在免疫細胞化學染色前常需去除，去鋨在光鏡水平常用1%的高錳酸鉀，在電鏡水平則常用H2O2來處理。,實用免疫細胞與核酸：一、固定劑,一、固定劑：,以上介紹了目前免疫細胞化學中常用的一些固定液。關于固定液種類還很多，如70%90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%1%醋酸的70%90%的酒精等），這些