1、鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù),鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測,針對病原體本身的生長繁殖、生理生化特性的檢測：鼠疫菌的染色檢查；鼠疫菌的培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)；鼠疫菌的生化檢查、營養(yǎng)需求、毒素檢測、毒力測定等。 針對病原體特異性抗原結(jié)構(gòu)的檢測：鼠疫F1抗原抗體檢測；鼠疫菌外膜蛋白的檢測。 針對病原體遺傳基因的檢測：鼠疫菌的質(zhì)粒檢測；鼠疫菌特異性核酸片斷的檢測；鼠疫菌全基因組測定；插入序列的檢測。,一、鼠疫菌菌體形態(tài)檢查,典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長12m，寬0.50.7m,中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染的卵圓形小桿菌，有莢膜，無鞭毛，無芽胞。革蘭氏染色陰性。 染疫動物或患者及其尸體的新鮮臟器制備的壓印片，可見到兩端鈍圓、兩

2、極濃染的典型鼠疫菌。壓印標(biāo)本中可在吞噬細(xì)胞內(nèi)外見到鼠疫菌，對于鑒別雜菌污染材料極有價(jià)值。 鼠疫菌染色方法有革蘭氏染色（菌體染成紅色）、美蘭染色（菌體染成蘭色，兩極濃染明顯）、姬姆薩染色（菌體染成色，莢膜染成色）,鼠疫菌染色檢查(臟器壓印片),美蘭染色,革蘭氏染色,鼠疫菌染色,鼠疫菌涂片的革蘭氏染色,鼠疫菌染色檢查,Wayson stain(魏申氏染色)呈現(xiàn)的兩極濃染特征,莢膜染色墨汁負(fù)染色,二、鼠疫菌的培養(yǎng)特性,鼠疫菌是典型的異養(yǎng)菌。 鼠疫菌為需氧菌，亦為兼性厭氧菌。 鼠疫菌在普通培基上生長良好，培養(yǎng)的最適溫度為28，最適pH為6.9-7.1，發(fā)育初期的最適氧化還原電位（Eh）約為100150

3、mV，接種后至少20h以上才能形成肉眼可見的菌落，一般2448h形成肉眼可見的小菌落。 強(qiáng)毒鼠疫菌對鈣離子有半依賴性，缺乏時(shí)生長不良。37缺鈣條件下強(qiáng)毒鼠疫菌生長受限并釋放大量Yops,表現(xiàn)很強(qiáng)的表達(dá)和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此現(xiàn)象稱為低鈣反應(yīng)，受70kb(45MD)質(zhì)粒上的遺傳基因控制。 典型鼠疫菌培養(yǎng)18-20h光鏡下呈透明的碎玻璃片狀。培養(yǎng)24h以上菌落在透過光線下呈灰白色略帶淡青色，反射光線下菌落圓形隆起呈淡灰白色，鏡下見菌落中心發(fā)暗，有黃褐色粗糙顆粒，周邊圍繞一圈寬窄不等，邊緣不整呈鋸齒狀、薄而透明的花邊。,鼠疫噬菌體試驗(yàn),在培基上密集平行劃線培養(yǎng)鼠疫菌，鼠疫噬菌體滴于上端劃

4、線中部，直立平板，使噬菌體液垂直劃線自然流下，置20培養(yǎng)24h,有明顯的噬菌帶。 在1822鼠疫噬菌體只能裂解鼠疫菌而不裂解假結(jié)核菌，具有較強(qiáng)的專一性(噬菌作用具有種的特異性)，是鼠疫細(xì)菌學(xué)診斷中特異的鑒定方法之一。 鼠疫噬菌體試驗(yàn)可快速診斷鼠疫菌。對被檢材料作細(xì)菌分離培養(yǎng)的同時(shí)作噬菌體裂解試驗(yàn)，20h左右即可獲得結(jié)果。 分離到鼠疫噬菌體，可以間接判定檢材中存在鼠疫菌。,鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn),典型鼠疫菌菌落形態(tài),噬菌帶,鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn),鼠疫菌培養(yǎng)特征,鼠疫噬菌體試驗(yàn),三、鼠疫F1抗原、抗體檢測,鼠疫F1抗原檢測 1.反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA) 2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELIS

5、A) 3.膠體金免疫層析法(GICA) 4.免疫熒光技術(shù)(IFT),鼠疫F1抗體檢測 1.間接血球凝集試驗(yàn)(IHA) 2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 3.膠體金免疫層析法(GICA),間接紅血球凝集試驗(yàn)(IHA),鼠疫菌特異性F1抗原致敏經(jīng)單寧酸鞣化處理的醛化綿羊紅血球，制備成F1抗原致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗體。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定均為常規(guī)操作。 IHA微量法結(jié)果：,反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA),用F1抗體致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗原。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定與IHA相同。 RIHA微量法結(jié)果：,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),測抗體. 雙抗原夾心法：F1抗原包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本28

6、反應(yīng)1.5h洗板，加入HRP-F1抗原28反應(yīng)1h洗板，加入底物OPD蔽光反應(yīng)30min后加終止液(2mol/L硫酸)。 間接法： 已知F1抗原包被反應(yīng)板，加標(biāo)本37反應(yīng)1h洗板，加入酶標(biāo)二抗37反應(yīng)1h洗板，加入底物(如OPD或TMB)蔽光反應(yīng)30min顯色后加終止液。 用肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值(A),測抗原 雙單抗夾心法： F1-McAb包被反應(yīng)板，加入標(biāo)本28反應(yīng)1.5h洗板，加入HRP-F1McAb 28反應(yīng)1h洗板，加入底物OPD蔽光反應(yīng)30min后加終止液。 雙抗體夾心法(改良法-美國CDC鼠疫診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室操作手冊)：鼠疫免疫血清特異性抗體( F1Ab)包被反應(yīng)

7、板，加標(biāo)本37反應(yīng)1h洗板，加小鼠F1McAb 液37靜置1h洗板，加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 37反應(yīng)1h洗板,加底物OPD蔽光反應(yīng)30min顯色，加終止液。 肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值(A),膠體金免疫層析法(GICA),檢測鼠疫菌特異性抗原、抗體的金標(biāo)技術(shù)以GICA廣泛用于實(shí)踐?；驹砭鶠閵A心法。 雙抗體夾心法測抗原：固定于NC膜上的單抗(F1McAb)+標(biāo)本中待測抗原(F1Ag)+金標(biāo)記的另一株單抗(金標(biāo)-F1McAb)顯色。 雙抗原夾心法測抗體：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+標(biāo)本中待測抗體(F1Ab)+金標(biāo)記的F1抗原(金標(biāo)-F1Ag)顯色。 夾心法測抗

8、體：固定于膜上的鼠疫F1抗原標(biāo)本中的相應(yīng)抗體金標(biāo)記的SPA顯色。,GICA雙抗體夾心法測抗原,G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(鼠型F1McAb),C區(qū)：羊抗小鼠Ig,T區(qū)：特異性單克隆抗體(F1McAb),吸水紙,標(biāo)本,免疫熒光技術(shù)(IFT),標(biāo)記物-熒光素(如異硫氰熒光素FITC) 熒光素標(biāo)記抗體檢測相應(yīng)抗原-直接法：如FITC-FIMcAb為異硫氰酸熒光黃標(biāo)記鼠疫F1單克隆抗體。 方法：固定好的玻片標(biāo)本用1%牛血清PBS浸洗5分鐘，流水沖洗。用FITC-FIMcAb適量（0.2ml）熒光染色，室溫作用30分鐘，流水沖洗。干燥，熒光顯微鏡油鏡觀察，鼠疫菌染上翠綠色熒光,Yersinia pestis

9、免疫熒光染色 Fluorescence antibody positivity is seen as bright, intense green staining around the bacterial cell,鼠疫菌特異性基因片斷檢測PCR,目標(biāo)基因：鼠疫菌的fra和pla特異性基因片段 引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長度 目標(biāo)基因 引物序列 產(chǎn)物長度 fra 1F 5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3 249 bp 1R 5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3 pla 2F 5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3 456 bp 2R 5-GTGACAT

10、AATATCCAGCGTTAATT-3 內(nèi)部對照：以鼠疫菌EV株DNA為模板，采用上述f1引物擴(kuò)增出fra基因249 bp片段，再以16SrRNA基因引物： F 5-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3 R 5-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3 擴(kuò)增出16SrRNA基因396bp片段加載體重組而成，產(chǎn)物長度645 bp ，使用了內(nèi)部對照，可有效的防止假陰性結(jié)果。 應(yīng)用多重PCR方法來檢測鼠疫菌，所選取的擴(kuò)增區(qū)域都為鼠疫菌的特異區(qū)域，可有效地將鼠疫菌與其它細(xì)菌相鑒別，具有較高特異性。,鼠疫PCR反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)體系(總量25l)采用其它總量時(shí)，下列配方按比例改變。 無菌去

11、離子水 13.5l 10反應(yīng)緩沖液 2.5l 4dNTP混合物（每種2.5mM） 2l 引物（1F、1R、2F、2R） 各1l 內(nèi)部對照模板(IC) 1l 待測標(biāo)本 1l Taq DNA 聚合酶 1l,鼠疫PCR,反應(yīng)條件(擴(kuò)增) ：預(yù)變性95 5min，1個(gè)循環(huán)；然后95 1 min，55 1 min，72 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 5 min。共1小時(shí)40分。 電泳：反應(yīng)管中加溴酚藍(lán)指示劑5l，混均短暫離心。膠體的每一孔中加入上述處理的反應(yīng)產(chǎn)物8l，在80-100V(不超過5V/cm)電壓下TBE緩沖液中電泳約1小時(shí)。凝膠成像儀讀取結(jié)果并照相。,多重PCR擴(kuò)增結(jié)果,鼠疫PCR 內(nèi)部

12、對照質(zhì)粒與不同濃度EV菌 PCR擴(kuò)增結(jié)果,鼠疫多重PCR 多重PCR擴(kuò)增結(jié)果,鼠疫菌質(zhì)粒檢測,鼠疫菌的三個(gè)尋常質(zhì)粒： pPCP1 6Mda(9.5kb)編碼鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞漿素原活化因子； pCD145 Mda(70kb)編碼型分泌系統(tǒng)的質(zhì)粒，即主要編碼低鈣反應(yīng)并表達(dá)LrcV及一系列耶爾森菌特有的Yops； pMT1 65Mda(100kb)編碼F1抗原和鼠毒素。 91001全基因組測序新發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒：pCRY長度21742bp，具有獨(dú)立復(fù)制能力，有一群編碼型分泌系統(tǒng)的基因。 質(zhì)粒DNA提取-堿裂解法和熱裂解法 質(zhì)粒電泳分析,鼠疫菌研究進(jìn)展,傳統(tǒng)的病原體分類(classification)和鑒定(identification)方法: 病原體的形態(tài)特征 生長特征(培養(yǎng)特性) 血清學(xué)反應(yīng) 生化特征 基因分類(Genotyping)和鑒定方法:多是基于PCR和核酸凝膠電泳技術(shù)，通過電泳條帶模式比較分析，