1、第三章 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,本章主要內(nèi)容,第一節(jié) 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié) 第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,概述,動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)定義： 是通過特定技術(shù)獲得優(yōu)良的動(dòng)物和植物細(xì)胞，然后在人工控制條件的反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以獲得所需產(chǎn)物的技術(shù)過程。,概述,第一節(jié) 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié),動(dòng)植物細(xì)胞更復(fù)雜，調(diào)節(jié)層次更多。 細(xì)胞水平 個(gè)體水平（激素、神經(jīng)水平） 下面著重從細(xì)胞水平討論。,第一節(jié) 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié),一、細(xì)胞分化改變酶的生物合成 原因：基因表達(dá)具有時(shí)空性 如： 胰蛋白酶主要在胰細(xì)胞中合成 木瓜蛋白酶主要在果皮細(xì)胞中合成 端粒酶在胚胎細(xì)胞、生殖細(xì)胞、

2、干細(xì)胞、分化程度低的癌細(xì)胞中具活性。,第一節(jié) 動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié),2、基因擴(kuò)增加速酶的生物合成 即通過增加基因的數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方式。如：對(duì)藥物的抗性。 3、增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成 增強(qiáng)子能促進(jìn)同源或異源啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。 4、抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成 半抗原誘導(dǎo)法 酶蛋白誘導(dǎo)法,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,含酶制品嫩肉粉,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,一、植物細(xì)胞的特性 大 生長(zhǎng)及代謝率低 營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單 需光 對(duì)剪切力敏感 生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) 提高產(chǎn)率 縮短周期 易于管理，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度 提高產(chǎn)品質(zhì)量 其他：需光照等,第二節(jié) 植物細(xì)

3、胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,外植體的選擇和處理愈傷組織的誘導(dǎo) 細(xì)胞的獲取細(xì)胞培養(yǎng)分離純化產(chǎn)物,外植體的選擇與處理： 選擇外植體、切取片段、消毒處理。,植物愈傷組織,直接分離法,機(jī)械搗碎發(fā)：動(dòng)作輕柔,酶分解法：纖維素酶、果膠酶等,過濾、離心分離,愈傷組織誘導(dǎo)法,能迅速增殖、無(wú)特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細(xì)胞團(tuán),外植體,半固體培養(yǎng)基,滅菌、冷卻,生長(zhǎng)素、分裂素,插入,培養(yǎng),25,愈傷組織,1-3周,分散、接種,原生質(zhì)體再生,去除細(xì)胞壁后得到的微球體,三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 （一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程,植物細(xì)胞的獲?。?第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 （一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程

4、 外植體細(xì)胞的獲取細(xì)胞培養(yǎng)分離純化產(chǎn)物 1、外植體的選擇與處理 2、植物細(xì)胞的獲取 3、細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 4、分離純化,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 （二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基 1、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的特點(diǎn) 與微生物培養(yǎng)基的主要不同點(diǎn)如下： （1）植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝需要大量的無(wú)機(jī)鹽 （2）植物細(xì)胞需要多種維生素和植物生長(zhǎng)激素 （3）植物細(xì)胞要求的氮源一般為無(wú)機(jī)氮源 （4）植物細(xì)胞一般以蔗糖為碳源,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 （二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基 2、幾種常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基 1）MS培養(yǎng)基 硝酸鹽濃度高，廣泛用于培養(yǎng)植物細(xì)胞、組

5、織及原生質(zhì)體。 2）B5培養(yǎng)基 銨的濃度較低，適于雙子葉植物特別是木本植物的組織、細(xì)胞培養(yǎng)。 3）White培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽濃度低，適用于生根培養(yǎng)。 4）KM-8P培養(yǎng)基 主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)。,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 （二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基 3、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制 為取用方便及減小誤差，先配成母液保存?zhèn)溆谩?（1）大量元素母液：即含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的無(wú)機(jī)鹽混合液。一般配成10倍濃度的母液。需單獨(dú)溶解，按順序攪拌混合。避免生成沉淀。 （2）微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的無(wú)機(jī)鹽混合液。一般

6、配制成100倍濃度的母液。,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 （二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基 3、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制 （3）鐵鹽母液：?jiǎn)为?dú)配制，一般采用敖和鐵，通常配制成100倍濃度母液。 （4）維生素母液：是各種維生素和氨基酸的混合液，一般配成100倍濃度母液。 （5）植物激素母液：各種植物激素單獨(dú)配制成母液。一般濃度為100mg/L.（注：一般難溶于水，需先用有機(jī)溶劑或酸、堿溶解，再用水定容。）,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 （三）溫度的控制：一般室溫（25左右） 溫度高，有利細(xì)胞生長(zhǎng)； 溫度低，有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物積累。 （四）pH

7、的控制：一般微酸性（Ph5.06.0） （五）溶解氧的控制:通風(fēng)攪拌供給（不能太劇烈）。,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制 （六）光照的控制：對(duì)強(qiáng)度及時(shí)間有要求。 （七）前體的添加：前提指處于目的代謝途徑上游的物質(zhì)。 （八）刺激劑的應(yīng)用：微生物細(xì)胞壁碎片、果膠酶、纖維素酶等微生物胞外酶。,第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,四、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程 1、大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 2、大蒜細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 3、超氧化物歧化酶的分離純化,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,由于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)具有明顯的表達(dá)產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無(wú)法取代，因此，生物技術(shù)中許多有價(jià)值的生物制品，需要借助于

8、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進(jìn)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,早在1907年，美國(guó)的Harrison在世界上首次將蛙的神經(jīng)組織在試管內(nèi)培養(yǎng)成功，建立起動(dòng)物組織體外培養(yǎng)的第一塊基石。 1950年前后，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關(guān)于在培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)病毒的報(bào)告，開拓了以動(dòng)物病毒為研究對(duì)象的新領(lǐng)域。 作為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，Copsik等人成功的進(jìn)行了有關(guān)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到有許多基因產(chǎn)物不能在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它們需要經(jīng)過真核細(xì)胞所特有的翻譯后修飾，以及正確的切割、折疊后，才能形成與自然分子一樣的功能和

9、抗原性。使得動(dòng)物細(xì)胞一躍成為一種重要的宿主細(xì)胞，用以生產(chǎn)多種生物制品等。這些采用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)貴重藥品在臨床診斷、治療和預(yù)防等方面都有重要意義。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的不同點(diǎn),a.動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差； b.生長(zhǎng)速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素； c.大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞需附著在固體或半固體的表面生長(zhǎng)； d.對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格； e.大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，不可簡(jiǎn)單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)十分緩慢，并易為大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的威脅最大，因?yàn)槠涓腥玖?qiáng)且不易檢出。 因此，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)成功的必要條件是要有

10、一個(gè)設(shè)備精良的細(xì)胞庫(kù)。在細(xì)胞庫(kù)中的冷凍細(xì)胞不受污染。,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配方十分復(fù)雜，并且還需補(bǔ)充血清。 原料的質(zhì)量控制和培養(yǎng)基的生產(chǎn)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題。 因?yàn)檠鍋?lái)源困難，質(zhì)量不穩(wěn)定，殘留血清給產(chǎn)物提純帶來(lái)困難等。,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)下列功能蛋白質(zhì)： 疫苗 激素 多肽生長(zhǎng)因子 酶 單克隆抗體 非抗體免疫調(diào)節(jié)劑,狂犬病疫苗培養(yǎng)VERO（非洲綠猴腎細(xì)胞）生產(chǎn),重組人白細(xì)胞干擾素,一、動(dòng)物細(xì)胞的特性,（1）沒有細(xì)胞壁，細(xì)胞適應(yīng)能力差，十分脆弱。 （2）體積比微生物大，比植物細(xì)胞稍小。 （3）相互粘連以集群形式存在。 （4）營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜

11、，培養(yǎng)基一般要添加血清。,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),（1）主要用于功能蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn) （2）生長(zhǎng)較慢，15-100h （3）需要添加抗生素以防染菌 （4）無(wú)細(xì)胞壁，體積較大，對(duì)剪切力敏感，要求嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件如通風(fēng)、攪拌、pH、滲透壓等 （5）大部分動(dòng)物細(xì)胞有錨地依賴性，需要貼壁培養(yǎng) （6）培養(yǎng)基成分復(fù)雜，分離純化復(fù)雜，成本較高，多用于高價(jià)值藥物的生產(chǎn) （7）原代細(xì)胞培養(yǎng)50代之后即會(huì)退化死亡，需要重新分離細(xì)胞,三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式,1、懸浮培養(yǎng)：血液細(xì)胞等 對(duì)剪切力敏感 2、貼壁培養(yǎng)：上皮、成纖維細(xì)胞等。 滾瓶培養(yǎng) 微載體培養(yǎng) 3、固定化細(xì)胞培養(yǎng) 吸附法 包埋法,培養(yǎng)瓶,CGIII-12

12、懸浮、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī),細(xì)胞培養(yǎng)微載體系統(tǒng),四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制,工藝流程： 制備細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)收集培養(yǎng)液分離純化目的物,培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的步驟,1.無(wú)菌取出目的細(xì)胞所在的組織用培養(yǎng)液漂洗干凈； 2.用無(wú)菌刀割掉多余部分并切成小組織塊； 3.小組織塊置于解離液中離散細(xì)胞； 4.低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移到培養(yǎng)瓶中。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),小鼠組織塊 ，用胰蛋白酶處理后變成單個(gè)細(xì)胞， 24h后（貼壁生長(zhǎng)）的成纖維細(xì)胞,（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成成分,氨基酸： 必需氨基酸 谷氨酰胺作碳源及能源 維生素 血清提供或補(bǔ)充B族維生素、Vc等 無(wú)機(jī)鹽 調(diào)節(jié)滲透壓、提供必需元素等,葡萄糖 作碳

13、源及能源 激素 維持正常的分裂與代謝（血清提供或添加） 生長(zhǎng)因子 血清提供或添加,（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制,自制：配制母液并過濾除菌備用 無(wú)血清培養(yǎng)基特定營(yíng)養(yǎng)成分的添加 購(gòu)買：商品化培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)用小牛血清,無(wú)血清動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基,Wako(和光純藥)細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基Sericin GIT,（三）溫度的控制,溫度影響生長(zhǎng)與代謝 36.5+0.25 溫度影響pH（通過影響CO2的溶解度影響pH）,（四）pH的控制,一般控制在pH7.07.6微堿性范圍，通常pH7.4下生長(zhǎng)最好。 調(diào)節(jié)方法：通常用CO2與NaHCO3 維持pH穩(wěn)定：緩沖系統(tǒng) CO2與NaHCO3系統(tǒng) 、檸檬酸與檸檬酸鹽系統(tǒng)等 pH監(jiān)測(cè)：酚紅指示劑 pH7.6 藍(lán)紅色 pH 7.4紅色 橙色pH7.0 黃色pH6.5,（五）滲透壓的控制 等滲溶液 700850 kPa （六）溶解氧的控制 量：過多過少都不行 控制：通過調(diào)節(jié)進(jìn)入反應(yīng)器的混合氣體的量及其比例調(diào)劑控制溶解氧（混合氣體含4種氣體：空氣、氧氣、氮?dú)?、二氧化碳?/p>