1、第三講 藥物蛋白質(zhì)組學(xué) Pharmacoproteomics,一、概念和研究內(nèi)容,Pharmacoproteomics: proteomics applied to pharmacology. 藥物蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)組學(xué)與藥學(xué)的學(xué)科交叉而逐漸形成新的研究領(lǐng)域。 研究內(nèi)容： 臨床前： 發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點(diǎn)以及針對(duì)這些靶點(diǎn)的全部可能的化合物 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機(jī)制和毒理學(xué) 臨床研究： 藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志物 應(yīng)用類似于藥物遺傳學(xué)的方法，按照蛋白質(zhì)譜來分類患者，給予個(gè)體化治療，并預(yù)測藥物療效。,運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的策略發(fā)現(xiàn)與藥物作用相關(guān)的蛋白

2、質(zhì),二、藥物作用靶點(diǎn)研究,通過研究比較疾病或藥物作用的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，可發(fā)現(xiàn)影響疾病或藥物作用的關(guān)鍵蛋白或生化途徑，再綜合分析蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，便可推測新的、潛在的藥物作用靶標(biāo)。 直接發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)活性小分子藥物的藥靶： 小分子藥物直接與蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)組技術(shù)，如親和色譜法、酵母三雜交、蛋白質(zhì)芯片、噬菌體展示技術(shù)、基于蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)組方法以及結(jié)構(gòu)蛋白組學(xué)技術(shù)等。,藥物作用靶點(diǎn)研究策略和方法,通過差異表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo) 蛋白質(zhì)活性表達(dá)譜（activity-based protein profiling, ABPP）分析 親和色譜法(affinity chromatography)

3、直接分離活性小分子的結(jié)合蛋白 酵母三雜交系統(tǒng)鑒定藥物靶點(diǎn) 噬菌體展示技術(shù),通過差異表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo),2、蛋白質(zhì)活性表達(dá)譜（activity-based protein profiling, ABPP）分析,activity-based probes（ABPs）：包含結(jié)合/反應(yīng)基團(tuán)和分析標(biāo)簽（如熒光素） 設(shè)計(jì)的探針分子僅結(jié)合蛋白（酶）的活性形式，因此通過測定熒光能間接測定蛋白活性。 優(yōu)點(diǎn)是通過測定酶活性代替測定蛋白的結(jié)合或蛋白表達(dá)水平,PNAS August 6, 2002 vol. 99 no. 16 1033510340,Nature 422, 226-232 (13 March 20

4、03),3、親和色譜法(affinity chromatography) 直接分離活性小分子的結(jié)合蛋白,基本原理：將活性小分子配體的某些功能基團(tuán)（羧基或氨基）與水不溶性載體（樹脂或瓊脂糖珠）通過連接臂連接作為固定相，制成親和吸附柱；然后將蛋白提取液或細(xì)胞裂解液通過親和柱，用緩沖液充分洗滌非結(jié)合蛋白，與小分子配基親和結(jié)合的蛋白留在柱上；最后通過干擾配基與靶蛋白相互作用的條件溶液（如蛋白變性溶液或用游離的配基競爭結(jié)合）解吸附結(jié)合于親和柱上的蛋白。洗脫出來的蛋白通常可用凝膠電泳法鑒定后再用MALDI-TOF MS分析，或消化成多肽后用液質(zhì)串聯(lián)色譜（LC-MS/MS）分析，也可進(jìn)行免疫分析。,成功的例

5、子,Yamamoto等應(yīng)用連續(xù)親和色譜法成功分離和鑒定了免疫抑制劑FK506的特異性結(jié)合蛋白FKBP12。 Anal Biochem. 2006 May 1;352(1):15-23. Bach等用同樣的方法成功鑒定了抗癌藥Roscovitine 能特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)多個(gè)激酶CDK5， ERK1，和ERK2。 J Biol Chem. 2005 Sep 2;280(35):31208-19.,4、酵母三雜交系統(tǒng)鑒定藥物靶點(diǎn),酵母雙雜交系統(tǒng)廣泛用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，在此基礎(chǔ)上發(fā)展的酵母三雜交系統(tǒng)將應(yīng)用范圍擴(kuò)展到蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)RNA、蛋白質(zhì)小分子化合物等更廣闊的研究領(lǐng)域。 BD：DNA

6、結(jié)合域 AD：轉(zhuǎn)錄激活域 DHFR：二氫葉酸還原酶 MTX：甲氨喋呤,成功的例子,Becker等先通過連接臂聚乙烯乙二醇共價(jià)連接CDK抑制劑purvalanol B和MTX，再將此化合物加入表達(dá)DHFR-BD融合蛋白和激酶cDNA文庫AD融合蛋白的酵母菌，檢測報(bào)告基因的表達(dá)，鑒定了purvalanol B的已知靶蛋白CDK1、CDK5和CDK6，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了新的激酶靶蛋白CDC/CDK樣蛋白CDC樣激酶3(CLK3)、PCTAIRE蛋白激酶1(PCTK1)和PCTK2、絲/蘇氨酸激酶p21(CDKN1A)激活的激酶4(PAK4)、核糖體蛋白S6激酶3(RSK3)、非受體酪氨酸激酶FYK和yam

7、aguchi肉瘤癌基因(YES)、受體酪氨酸激酶ephrin受體B2(EPHB2)和fms相關(guān)酪氨酸激酶4(FLT4)。 Chem Biol. 2004 Feb;11(2):211-23 Licitra應(yīng)用酵母三雜交系統(tǒng)成功確認(rèn)他克莫司(FK506)藥靶FKBP12(FK506binding protein) Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 12;93(23):12817-21,三、藥物蛋白質(zhì)學(xué)在臨床診斷和治療中的應(yīng)用,應(yīng)用藥物蛋白質(zhì)組學(xué)可篩選出疾病特異性蛋白質(zhì)，可作為疾病分類分型和臨床診斷的標(biāo)志，還可作為評(píng)價(jià)藥物療效及預(yù)測疾病預(yù)后的依據(jù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物個(gè)體

8、化治療。,1、發(fā)現(xiàn)疾病特異性生物標(biāo)記物進(jìn)行診斷及預(yù)測疾病的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸,應(yīng)用蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)能夠動(dòng)態(tài)、整體地觀察疾病發(fā)生過程中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的變化，通過比較正常和疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，可以鑒定出疾病特異性生物標(biāo)記物（biomarker)。 Biomarker： A characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeu

9、tic intervention。 FDA draft Pharmacogenomics Guidance Diagnosis Tool for staging disease Indicator of disease status Predict and/or monitor clinical response to an intervention,生物標(biāo)記物（biomarker),Biomarkers are the foundation of evidence based medicine-who should be treated, how and with what Absent n

10、ew markers, advances in more targeted therapy will be limited and treatment will remain largely empirical It is imperative that biomarker development be accelerated along with therapeutics,Example,(A) Specific populations of cells were recovered using laser under microscopic observation.,(B) The ext

11、racted proteins were labeled with fluorescent dyes and separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE). (C) Evaluation of the reproducibility of 2D-DIGE by scatter graphs.,Results of hierarchical clustering were associated with histological grouping: the seven normal liver

12、tissues, 11 adjacent nontumor tissues, six well-differentiated HCCs, and one moderately-differentiated HCC were grouped together, while the 13 moderately-differentiated HCCs and seven poorly-differentiated HCCs were clustered together forming a separate group (A). Principal component analysis also s

13、howed similar results (B),Among the identified proteins, EB1 is controlled by c-Myc, RhoA and CDC42, which have all been linked toHCC malignancy in previous reports,2、評(píng)價(jià)藥物療效,大多數(shù)藥物和疾病的靶點(diǎn)是蛋白質(zhì)，可以認(rèn)為，如果一個(gè)藥物能夠使疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)的表現(xiàn)與正常狀態(tài)越接近，表明這個(gè)藥物的治療效果越好。,Example,3、研究藥物毒理機(jī)制進(jìn)行藥物毒性生物標(biāo)志物的監(jiān)控,通過藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究可準(zhǔn)確、快速地揭示藥物的毒副作用

14、。 檢測經(jīng)藥物刺激的組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，建立其蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，有助于了解它們的毒理學(xué)機(jī)制，并建立可用于評(píng)估其安全性的生物標(biāo)志物。 例如：慶大霉素明顯的毒副作用是腎毒性。 Kennedy等運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究了慶大霉素治療后的大鼠血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)持續(xù)高表達(dá)的蛋白，此蛋白可能參與了補(bǔ)體的替代途徑激活過程，并且能夠與腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞結(jié)合，有望成為評(píng)價(jià)慶大霉素毒性的非侵人性標(biāo)志物。 Toxicol Lett, 2001, 120(1.3):379-384,四、抗腫瘤藥多藥耐藥機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,Multidrug resistance (MDR) in cancer： 腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥

15、性后，對(duì)其它的多種化療藥物也產(chǎn)生不同程度的藥耐性，致使藥物的療效不斷的下降。 MDR is a significant obstacle to the success of chemotherapy MDR that develops in cancer cells often results from elevated expression of particular proteins such as cell-membrane transporters,Potential mechanisms of chemoresistance suggestedby various published

16、 pharmacoproteomic studies,(A) drugsequestration, (B) modulation of PKC activity, (C) apoptosis, and (D) modulation of cytoskeleton organization Mitoxantrone:米托蒽醌；FABP:fatty acid binding protein(脂肪酸結(jié)合蛋白）；Thioedoxin:硫氧還原蛋白；Rho-GDP解離抑制因子；Annexins:膜聯(lián)蛋白；MAP:microtubule-associated protein(微管相關(guān)蛋白）,Protein

17、s identified by the proteomic approach in cancer cell lines resistant to different anti-cancer drugs,anti-cancer drugs: a mitoxantrone, b daunorubicin, c etoposide, d doxorubicin, e paclitaxel, f cisplatin, g vincristine and h antimitotic compound,五、基于蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的抗腫瘤藥物化療敏感性預(yù)測,化學(xué)治療是腫瘤的三大治療手段之一。近30年來，雖然某些

18、惡性腫瘤的化學(xué)治療有明顯改善，但多數(shù)腫瘤，特別是實(shí)體瘤療效仍不理想。這與腫瘤存在個(gè)體差異性，以及多重耐藥性等因素有關(guān)。 如何選擇有效藥物，進(jìn)行個(gè)體化的治療早已成為化療界所關(guān)注的問題。,傳統(tǒng)藥敏檢測方法及其存在的問題,藥敏檢測方法,存在問題,集落形成法（HTCA）,標(biāo)本可評(píng)價(jià)率低，僅有4070。 實(shí)驗(yàn)周期長，需要2周以上 測試藥物種類和數(shù)量有限 操作繁瑣，難以標(biāo)準(zhǔn)化 陽性預(yù)測值較低，僅有4060,四唑藍(lán)比色法 (MTT),敏感性較差，最低僅能檢測500個(gè)細(xì)胞 量程較小，有效量程在2.0以內(nèi),細(xì)胞毒性差異染色法 (DiSC),可適用標(biāo)本類型不廣，目前僅用于血液腫瘤 人為判斷因素較大，難以推廣 標(biāo)本

19、可評(píng)價(jià)率不高，僅有7080 陽性預(yù)測值較低，僅有7080,胸腺嘧啶核苷摻入法 (3H-TdR),實(shí)驗(yàn)人員接觸放射，不利于健康 標(biāo)本可評(píng)價(jià)率不高，僅有7080 測試結(jié)果僅能反映少量處于增殖相的腫瘤細(xì)胞 對(duì)某些藥物的測試結(jié)果存在假陰性,The selective pressure exerted by drugs combined with cell heterogeneity (often a result of tumor genomic instability) is the driving force for drug resistance. In addition, tumors can

20、 regulate their own microenvironment by remodeling the extracellular matrix, deregulating cellcell contact and cellcell interactions with neighboring mesothelial and endothelial cells, and other changes such as increased hypoxia. Factors unrelated to the tumor but contributed by the host, e.g. gene

21、polymorphisms, also contribute to drug resistance.,Proteomic technology applied to cancer-patient management,Proteomic pattern analysis of serum has the potential to detect early-stage disease, toxicity or recurrence. Once the disease has been diagnosed and biopsied, protein microarrays coupled with

22、 laser-capture microdissection (LCM) offer a means to profile the individual signal pathways that are deranged in the tumour cells of the patient. In this manner, the combinatorial therapy can be tailored to, and monitored in, the individual patient.,Architecture of the model system for drug response prediction,Results:,Eight protein markers were identified for the prediction of drug response to 5-fluorouracil CDH1, CDH2, KRT8, ERBB2, MSN, MVP, MAP2K