1、植物葉中色素的提取和柱色譜分離實驗報告一實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)從植物中提取色素的方法。2、學(xué)習(xí)柱色譜(層析)的原理及其操作方法。3、掌握天然藥物化學(xué)實驗報告的一般寫法。二實驗原理1、綠色植物葉中含有葉綠素(綠)、胡蘿卜素(橙)和葉黃素(黃)等多種天然色素。各種色素能溶解在有機溶劑（無水乙醇等）中形成溶液，使色素從生物組織中脫離出來。2、柱色譜是通過色譜柱來實現(xiàn)分離的。在色譜柱內(nèi)裝有固體吸附劑(固定相)如氧化鋁或硅膠。液體樣品從柱頂加入，當(dāng)液體流經(jīng)吸附劑時，由于吸附劑表面對液體中各組分吸附能力不同而按一定的順序吸附。然后從柱頂加入洗脫劑(流動相)，樣品中的各組分隨洗脫劑按一定的順序從色譜柱下端流出，根

2、據(jù)不同顏色分段收集。吸附劑，常用吸附劑有氧化鋁、硅膠、氧化鎂等。吸附劑對化合物的吸附能力與分子的極性有關(guān)，極性越強，吸附能力越大，分子中含有極性較大的基團，其吸附能力也越強。溶劑，溶劑分為溶解樣品的溶劑和洗脫劑。選擇溶劑時還要考慮到被分離物各組分的極性和溶解度。通常是先將要分離的樣品溶于非極性溶劑中，從柱頂加入柱中。然后用稍大極性的溶劑使各組分在柱中形成若干譜帶。再用極性更大的溶劑洗脫被吸附的物質(zhì)。為了提高洗脫效果，有時也使用混合溶劑。在本實驗中色素成分在不同比例混合洗脫劑的作用下可以分離出來。三實驗儀器及試劑儀器：燒杯、量筒、色譜柱、分液漏斗、玻璃棒 、干燥的錐形瓶、濾紙、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 、酸式

3、滴定管、布氏漏斗、研缽、膠頭滴管、剪刀、天平試劑：50g新鮮植物葉、中性氧化鋁、甲醇 ( 9 5 ，分 析 純 ) 、乙醇、石油醚 ( 6 0 9 0 ) 、丙酮 、無水硫酸鈉 、正丁醇 、50g新鮮植物葉、四實驗內(nèi)容1. 綠葉色素的提取把新鮮綠葉洗凈晾干或用濾紙吸干，稱取5g綠葉，剪碎后放入研缽，再加入10mL乙醇。研磨后用布氏漏斗抽濾，棄去濾渣。將濾液放回研缽，每次用10mL 3:2 （體積比）的石油醚 - 甲醇混合液萃取兩次，每次需加以研磨并且抽濾。把兩次濾液合并，轉(zhuǎn)入分液漏斗中。用5mL水洗滌兩次，棄去水-甲醇層, 洗滌時要輕輕旋蕩，以防止產(chǎn)生乳化。石油醚層轉(zhuǎn)入干燥的錐形瓶中用無水硫酸

4、鈉干燥。干燥后的液體在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸除石油醚至體積約2mL左右。2.柱色譜分離色素取一支干凈的酸式滴定管，向柱內(nèi)加入石油醚至柱高約1/2處。再緩慢加入氧化鋁，并打開活塞 ，控制流出速度約為2滴/s ，并保持液面不低于固定相。打開下端活塞，放出溶劑，直到氧化鋁表面溶劑剩下 12mm 高時關(guān)上活塞。注意，在任何情況下，氧化鋁表面不得露出液面。色素濃溶液用滴管小心加到色譜柱頂部，并要旋轉(zhuǎn)加入。加完后打開下部活塞，讓液面下降到柱面以下1mm左右關(guān)閉活塞。旋轉(zhuǎn)加入數(shù)滴石油醚，重新打開活塞使液面下降，重復(fù)幾次使有色物質(zhì)全部進入柱體內(nèi)，待色素全部進入柱體后，觀察并記錄下此時實驗的現(xiàn)象。在柱頂小心加洗脫劑石油

5、醚 - 丙酮溶液 9:1 （體積比）。打開活塞，讓洗脫劑逐滴放出，層析即開始進行，用試管收集。當(dāng)?shù)谝粋€有色成分即將滴出時，取另一試管收集，得橙黃色溶液，它就是胡蘿卜素。用石油醚 - 丙酮 7:3 （體積比）作洗脫劑，分出第二個黃色帶，它是葉黃素 （1）。再用丁醇 - 乙醇 - 水 3:1:1 （體積比）洗脫葉綠素a（藍綠色）和葉綠素b（黃綠色）。五實驗結(jié)論與分析1、本次實驗總共重復(fù)了三次，第一次采用的是蠶豆葉，提取的色素濃液很少所以色素帶分層現(xiàn)象不明顯；第二次采用的是野草的嫩葉，提取出來的主要是淡黃色的色素，葉綠素較少；第三次因為時間關(guān)系采用了少量的是萵苣葉比較前兩次實驗，很遺憾實驗分層現(xiàn)象還

6、是不明顯。通過不同品種的原材料的選取，以及用量的多少對實驗很關(guān)鍵，總的來說還是用適當(dāng)?shù)倪^量的綠葉較好，可以避免轉(zhuǎn)移過程中的損失，而且綠葉最好是深綠色的肉質(zhì)植物。2、研磨時加入適量的乙醇有助于打開植物細胞壁，有利于色素的流出，第一次采用的是甲醇，第二次是石油醚，第三次是乙醇，實驗結(jié)果從提取的汁液來看第三次的汁液明顯是深綠色，第一次是淺綠，第二次是淡黃色。通過查閱文獻和實驗比較，提取色素過程中，由于抽濾時不好控制，非極性溶劑難免會被抽去，且在幾次轉(zhuǎn)移中損失較多，程序繁雜。用浸泡法操作簡便易行，損失少，產(chǎn)率高。因甲醇與乙醇的極性相近，乙醇易得，無毒，用95乙醇通過浸泡的方法提取菠菜色素為此實驗的優(yōu)化

7、條件 。3、固定相的選擇也是一個影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵，此次試驗我們組并未將氧化鋁和硅膠兩種固定相一起作比較，但從別組兩種比較的結(jié)果來看，通過比較，中性氧化鋁雖用量比硅膠稍大，但其裝柱 較容易，只要保持比較均勻的速度從 漏斗中加入，且輕輕敲打柱身，柱內(nèi)氣泡就較少，柱子裝的也比較實，色帶的分離效果比硅膠明顯。使用硅膠做固定相時，雖用量較少，但在裝柱過程中，容易 出現(xiàn)大量泡，會影響色帶的分離。為消除氣泡，采用吸耳球?qū)χ蛹訅?，將氣泡擠出柱體。但這種方法容易導(dǎo)致柱子的堵塞，而且在加壓過程中，脫脂棉上層的少許沙子常會堵在滴定管的尖嘴處，導(dǎo)致色帶分離時溶劑不易滴出，延長了實驗時間，還影響了色帶分離效果。但采

8、用硅膠做固定相時，第一個胡蘿卜素的橙黃色帶分離效果很好。同時用兩種固定相分離時，葉黃素的黃色色帶都分離不夠明顯，經(jīng)查閱資料認為葉黃素易溶于醇而在石油醚中溶解度較小，從嫩綠菠菜得到 的提 取液中，葉黃素含量很少，所以柱色譜中不易分出黃色帶。但比較兩者，采用硅膠分離時，黃色色帶幾乎看不出來。因此采取氧化鋁做實驗現(xiàn)象更明顯。用中性氧化鋁作為固定相裝柱效果最好。裝柱的時候采取干法裝柱效果較好。 同時需注意在柱的底部要鋪少許的脫脂棉以防止氧化鋁堵塞柱子尖嘴處 。裝 完柱后還要在柱的頂部鋪一層細沙，當(dāng)溶劑下降到沙層時要及時添加，以防柱 身干裂。色譜柱頂部的氧化鋁和沙層注意不要傾斜，如果傾斜會影響色帶的分離效果。同時保持2 滴/s 的速度放出溶液(使色帶均勻下移)，所加壓力不要太大。六實驗思考1、植物的綠葉在研磨時不要太爛而成糊狀導(dǎo)致不容易分離。2、葉綠素色素對光，溫度，氧氣，酸，堿及其它氧化劑都非常敏感，故色素的提取和分離應(yīng)避光。3、在洗脫過程中，不要大量放出溶液，以免固定相表面暴露導(dǎo)致柱子干裂。4、固定相的頂部保持水平，并且柱內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有