1、膠回收,-EZNAGel Extraction Kit,實(shí)驗(yàn)原理,回收柱（硅膠膜）在高鹽、低PH值的情況下吸附DNA，在低鹽、高PH值的情況下釋放DNA。 我們知道原理，就知道了影響膠回收的幾個(gè)影響因素，PH值、高鹽試劑、低鹽洗脫試劑。,實(shí)驗(yàn)步驟,1. RT-PCR的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外燈下觀察。為防DNA損傷，避免長(zhǎng)時(shí)間的紫外光照射。 2. 用刀片或凝膠尺切下含有所需DNA帶的凝膠，置于1.5ml離心管中，稱重。 3. 往離心管中加入膠重的等量體積的Binding Buffer（即每100mg膠加入100 ul Binding Buffer）. 4. 50水浴10分鐘，使凝膠完全

2、熔解，在水浴過程中每23分鐘漩渦震蕩混勻一次。 5. 將離心柱放入2ml收集管中，將上一步熔解的凝膠導(dǎo)入離心柱中，10,000g離心1分鐘。棄殘液。 6. 將離心柱重新放回收集管；加入300ul Binding Buffer，10,000g離心1分鐘。7. 棄去收集管中的液體，將柱子放回收集管，再加入700 ul SPW Wash Buffer，靜置2-3分鐘，10,000g離心1分鐘。 8. 重復(fù)步驟7一次。 9. 棄去收集管中的液體，空柱放回收集管，再10,000g離心1分鐘。 10. 將離心柱放入一個(gè)干凈的1.5ml離心管，加入2050ul去離子水到柱子內(nèi)部中央，放置2分鐘，離心1分鐘。

3、收集管中的溶液即為已純化的GAPDH基因DNA片段。,連接,1）在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 l。 pMD18-T Vector*1 1 l DNA 0.1 pmol0.3 pmol dH2O up to 5 l 2）加入5 l（等量）的 Solution I。 3）16反應(yīng)30分鐘。,pMD18-T Vector圖譜,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化(Transformation)：是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R

4、-, M-)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。,CaCl2轉(zhuǎn)化原理,正在生長(zhǎng)的大腸桿菌在0C下加入到低滲的冰冷的CaCl2溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹成球（感受態(tài)細(xì)胞）。 感受態(tài)細(xì)胞與外源質(zhì)粒DNA形成一種黏著在細(xì)胞表面上的對(duì)DNA酶抗性的羥基鈣磷酸復(fù)合物。 42C下作短暫的熱刺激期間，這種復(fù)合物便會(huì)被細(xì)胞吸收。 進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子。,轉(zhuǎn)化步驟,1. 于超凈臺(tái)中取連接產(chǎn)物10l與100l大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞混合，置冰浴中30分鐘。 2. 42熱休克90秒，置冰

5、浴中3-5分鐘。 3. 于超凈臺(tái)中加LB培養(yǎng)基900l，37水浴1小時(shí)。 4. 4000rpm離心3分鐘，棄上清，取殘余液體重懸細(xì)菌。 4. 取l上述混合物均勻涂布于含100g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。 5. 37孵箱培養(yǎng)1216小時(shí)，可見長(zhǎng)出單菌落。 6. 挑選單菌落，使用PCR法確認(rèn)T載體中插入片段的長(zhǎng)度大小，或提質(zhì)粒酶切、測(cè)序鑒定。,質(zhì)粒提取 -E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit I 原理：,在pH 12.0 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件

6、下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。,步驟：,挑選一個(gè)單菌落,37過夜培養(yǎng)1416小時(shí)。 取1.55ml 菌液，10,000g 離心1分鐘。 棄上清，加入250l 溶液I/RNase，漩渦震蕩重懸細(xì)胞。 加入250l溶液，輕柔上下顛倒旋轉(zhuǎn)混勻46次，室溫放置2分鐘。 加入350l溶液，輕柔上下顛倒混勻得到白色沉淀。 10,000g 離心10分鐘。 將上清轉(zhuǎn)移到HiBindTM DNA柱上,置于2ml離

7、心管上。注意不要吸到沉淀。 10,000g 離心1分鐘，棄殘液。 用500l HB buffer 洗柱，10,000g 離心1分鐘，去殘液。 用700l DNA wash buffer (乙醇稀釋)洗柱，10,000g離心1分鐘，去殘液。 用700l DNA wash buffer第二次洗柱10,000g離心1分鐘，去殘液。 空柱子10,000g離心1分鐘。 將HiBindTM DNA轉(zhuǎn)移至一干凈的1.5ml離心管，于膜中央加入50l ddH2O或TE溶解質(zhì)粒。10,000g 離心1分鐘收集質(zhì)粒。,核酸定量,核酸的定量的方法： （1）電泳比較法 。 （2）紫外分光光度法 紫外分光光度法比較常用

8、 核酸的最大吸收波長(zhǎng)是260nm，吸收低谷在230nm，這個(gè)物理特性為測(cè)定核酸溶液度提供了基礎(chǔ)。 A280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng),紫外分光光度法原理,測(cè)定核酸溶液在260 nm的光吸收，樣品溶液吸收光的量(吸光度)正比于溶液中溶質(zhì)的量。吸光度與溶液中核酸濃度間的轉(zhuǎn)換關(guān)系依據(jù)Lambert-Beer 定律： A=260 C L 其中：A：吸光度(OD)260 ：溶液中核酸在260 nm的摩爾消光系數(shù)(單位，L/mol.cm)C：溶液濃度(單位，mol/L)L：光路長(zhǎng)度(單位，cm),核酸純度分析,A280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng) A260/A280比值可進(jìn)行核酸

9、樣品純度評(píng)估： 理論上，純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA的A260/A280比值為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求，考慮是否純化樣品。,酶切限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）,一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶 . 在分子生物學(xué)與遺傳工程領(lǐng)域作為工具酶有廣泛的應(yīng)用 . 根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu),輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。,鑒定正反,TA克隆有兩種插入方式，造成正反向 常規(guī)PCR使得3端多出一個(gè)A堿基 5 nnnnnnnnnnA 3 3 A