1、.病毒鑒定的方法有哪些？從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離病毒，然后采用免疫熒光和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)已被成功地用于病毒的鑒定。目前最常用的病毒定量檢測(cè)方法有以下三大類：用于病毒感染力檢測(cè)的技術(shù)，如病毒空斑形成試驗(yàn)，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量tcid50 測(cè)定和免疫熒光等；病毒核酸和病毒蛋白檢測(cè)技術(shù)，如實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)（qpcr），免疫印跡，免疫沉淀，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ elisa）和血凝試驗(yàn)等；還有就是那些直接對(duì)病毒顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，如流式細(xì)胞分析或透射電鏡技術(shù)。病毒檢測(cè)方法的局限性病毒鑒定方法1. 培養(yǎng)細(xì)胞的顯微學(xué)觀察材料和儀器細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基： 含 10% fbs(胎牛血清 ), 4-6 mm

2、glutamine （谷氨酰胺） 的高葡萄糖 dmem，若有需要可加入青霉素，鏈霉素，慶大霉素，兩性霉素等維持培養(yǎng)基：上述新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，但血清fbs濃度減少至為 2%宿主細(xì)胞：鋪滿單層細(xì)胞的8 孔培養(yǎng)腔室玻片（chamber slides）pbs磷酸緩沖液bouins 固定液吉姆薩（ giemsa）緩沖液吉姆薩（ giemsa）染色液丙酮，丙酮：二甲苯（ 2:1），丙酮：二甲苯（ 1:2），二甲苯中性樹(shù)膠移液槍頭(10 到 100 微升 )移液管生物安全柜（超凈臺(tái)）二氧化碳培養(yǎng)箱倒置顯微鏡.實(shí)驗(yàn)方案接種宿主細(xì)胞至chamber slides：選擇合適的細(xì)胞接種密度（比如8-孔 chambe

3、r slides，接種30,000 細(xì)胞 / 孔），培養(yǎng)基為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（10%fbs-dmem）。輕輕地前后左右搖晃chamber slides 使細(xì)胞分布均勻。將細(xì)胞置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，第二天，顯微鏡下觀察細(xì)胞確認(rèn)細(xì)胞是否分布均勻并達(dá)到80%以上的融合度。制備不同稀釋度的病毒液：標(biāo)記 6 支無(wú)菌離心管， 第 1 管加入 990 l 細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，剩下 5 管加入 900 l 細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。按以下方法進(jìn)行梯度稀釋：在第1 管中加入10 l病毒原液（稀釋度1:100）充分混勻，然后從第1 管吸 100 l 至第 2 管中混勻，依次類推，進(jìn)行 10 倍梯度稀釋。管 1 至管 6 的稀釋度分別

4、為10-3 到 10-7。感染細(xì)胞：吸去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，每孔加入0.5 ml 維持培養(yǎng)液（ 2%fbs-dmem），再加入 100 l 不同稀釋度（ 10-2至 10-7 稀釋）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作為空白對(duì)照。將細(xì)胞置二氧化碳培養(yǎng)箱37oc 或 34oc 培養(yǎng) 1-4 周，追蹤觀察致細(xì)胞病變效應(yīng) （ cpe）發(fā)生情況。吉姆薩染色：一旦觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)，輕輕地用pbs將細(xì)胞洗3 次，每次 5min，然后加入 bouins 固定液固定 10 min 。用吉姆薩緩沖液洗3 次，然和加入giemsa 染液染色 1 h，再用吉姆薩緩沖液清洗后依次用丙酮處理15s，2:1 的丙酮 -二甲苯

5、處理30s，1:2 的丙酮 -二甲苯處理 30s，最后用二甲苯處理10 min 緊接著用中性樹(shù)膠封片。 顯微鏡下觀察 cpe，包涵體，細(xì)胞融合及病毒空泡形成情況。病毒感染細(xì)胞后形成的cpe圖片范例可以在很多圖譜， 網(wǎng)站和博客上找到，例如asm microbe library2.免疫熒光 (if)檢測(cè)方法材料和儀器細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基：含 10%fbs(胎牛血清 ), 4-6mm glutamine （谷氨酰胺）的高葡萄糖 dmem ，若有需要可加入青霉素，鏈霉素，慶大霉素，兩性霉素等宿主細(xì)胞：鋪滿單層細(xì)胞的8 孔培養(yǎng)腔室玻片（chamber slides）pbs磷酸緩沖液一抗fitc標(biāo)記的二抗細(xì)胞核

6、染料dapi5-4 %多聚甲醛（ pfa，ph7.4），或者甲醇移液槍頭(10 到 100 微升 )離心管生物安全柜（超凈臺(tái)）二氧化碳培養(yǎng)箱熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)方案接種宿主細(xì)胞至chamber slides：選擇合適的細(xì)胞接種密度（比如8-孔 chamber slides，接種30,000 細(xì)胞 / 孔），培養(yǎng)基為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（10%fbs-dmem）。輕輕地前后左右搖晃chamber slides 使細(xì)胞分布均勻。將細(xì)胞置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，第二天，顯微鏡下觀察細(xì)胞確認(rèn)細(xì)胞是否分布均勻并達(dá)到80%以上的融合度。病毒感染： 每孔細(xì)胞加0.1 ml 病毒儲(chǔ)存液， 留一孔不加作為陰性對(duì)照。將細(xì)胞放回co2

7、培養(yǎng)箱， 37 c 或 34 c 培養(yǎng) 48h 。.免疫熒光染色觀察：病毒感染48h 后，吸去培養(yǎng)液， 將細(xì)胞用預(yù)冷的甲醇固定5min（也可用新鮮制備的4%多聚甲醛固定）后，用含0.2% triton x 的 pbs室溫破膜 5min 。將細(xì)胞用pbs清洗后，加入推薦濃度的一抗孵育2h，pbs清洗 5 遍，然后再加入熒光（alexa fluor 488或 fitc）標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育， pbs清洗 5 遍，加入 dapi 染細(xì)胞核，在相差及熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。3.分子學(xué)方法用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄pcr（ real-time rt-pcr）來(lái)檢測(cè)流感病毒比終點(diǎn)檢測(cè)方法更為快捷，且敏感度跟細(xì)胞培養(yǎng)法相當(dāng)甚至更佳用分子技術(shù)從臨床樣本中直接對(duì)病毒基因組進(jìn)行鑒定是21 世紀(jì)的重大發(fā)現(xiàn)之一。核酸擴(kuò)增技術(shù)包括pcr、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)和勞倫斯利弗莫爾微生物檢測(cè)陣列(lmda)等都無(wú)疑是快速檢測(cè)和鑒定大多數(shù)已知人類病毒的領(lǐng)先技術(shù)。pcr 可以在體外 將 dna 序列的一段特定區(qū)域擴(kuò)增106 倍，因此是一種極其敏感的檢測(cè)手段。pcr還可以用于病毒rna的鑒定， 只需先將rna逆轉(zhuǎn)錄成dna，然后再進(jìn)行pcr分析，這一方法被稱之為逆轉(zhuǎn)錄pcr（rt-pcr）。采用特異性的引物鑒定甲型流感病毒。 m：marker ，陽(yáng)性對(duì)照 （ +），