1、實(shí)驗(yàn)五 乳制品中金黃色葡萄球菌檢測(cè),生物學(xué)特性-菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征,革蘭氏陽(yáng)性球菌，直徑為0.8-1.0微米，鏡檢時(shí)呈單個(gè)、成對(duì)、四聯(lián)或不規(guī)則的簇群； 無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)； 兼性厭氧菌，在好氧條件下生長(zhǎng)最好； 可在15%氯化鈉和40%膽汁中生長(zhǎng),生物學(xué)特性-菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征,大多數(shù)菌株能生長(zhǎng)在6.5-46之間（最適溫度30-37）能在pH4.2-9.3之間生長(zhǎng)（最適pH為7.0-7.5）； 大多數(shù)菌株產(chǎn)生類(lèi)胡羅卜素，使細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)出深橙色到淺黃色，色素的產(chǎn)生取決于生長(zhǎng)的條件，而且在單個(gè)菌株中可能也有變化,生物學(xué)特性-菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征,好氧生長(zhǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生接觸酶； 產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和

2、溶菌酶，大多數(shù)菌株可水解天然的動(dòng)物蛋白，例如血紅蛋白、纖維蛋白、卵白、酪朊和多肽類(lèi)如明膠，水解脂類(lèi)、吐溫類(lèi)和磷脂蛋白質(zhì)，并釋放脂肪酸； 所有的毒株產(chǎn)生凝固酶，人和動(dòng)物來(lái)源的菌株通?？赡掏谩⑷?、馬和豬的血漿。,致病性,金黃色葡萄球菌為條件致病菌，菌株致病力的強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶： a.溶血素：外毒素，分、四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死； b.殺白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞； c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)； d.脫氧核糖核酸

3、酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來(lái)作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌； e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E五種。,致病性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病，可引發(fā)不同程度的急性胃腸炎癥狀，惡心、嘔吐最為突出而且普遍，腹痛、腹瀉次之。 當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時(shí)，經(jīng)8-10小時(shí)即可相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。,分布,在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。 作為人和動(dòng)物的常見(jiàn)病原菌，其主要存在于人和動(dòng)物的鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康

4、人的皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。 傳播媒介為被該菌污染的食品，主要為淀粉類(lèi)(如剩飯、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及魚(yú)、肉、蛋類(lèi)等。被污染的食物在室溫20-22放置5小時(shí)以上時(shí)，病菌大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。,流行病學(xué),季節(jié)分布，多見(jiàn)于春夏季； 中毒食品種類(lèi)多，如奶、肉、蛋、魚(yú)及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。,流行病學(xué),金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問(wèn)題，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，我國(guó)每

5、年發(fā)生的此類(lèi)中毒事件也非常多。,流行病學(xué),腸毒素形成條件： 存放溫度，在37C內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時(shí)間越短； 存放地點(diǎn)，通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素； 食物種類(lèi)，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時(shí)含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。,耐受力,幾乎所有的消毒試劑以及熱加工過(guò)程對(duì)金黃色葡萄球菌都有嚴(yán)重的破壞作用 腸毒素可耐受100 30分鐘不被破壞。 對(duì)于加工過(guò)的食品或食品加工設(shè)備而言，此菌或其腸毒素的存在通常作為衛(wèi)生條件差的一種指標(biāo)。,污染的控制,防止金黃色葡萄球菌污染食品 防止帶菌人群對(duì)各種食物的污染：定期對(duì)生產(chǎn)加工人員進(jìn)行健康檢查，患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺

6、炎、口腔疾病等）的人員要暫時(shí)停止其工作或調(diào)換崗位。,污染的控制,防止金黃色葡萄球菌污染食品 防止金黃色葡萄球菌對(duì)奶及其制品的污染：如牛奶廠要定期檢查奶牛的乳房，不能擠用患化膿性乳腺炎的牛奶；奶擠出后，要迅速冷至-10以下，以防毒素生成、細(xì)菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶為原料，注意低溫保存。,污染的控制,防止金黃色葡萄球菌污染食品 對(duì)肉制品加工廠，患局部化膿感染的禽、畜尸體應(yīng)除去病變部位，經(jīng)高溫或其他適當(dāng)方式處理后進(jìn)行加工生產(chǎn)。,污染的控制,防止金黃色葡萄球菌腸毒素的生成 應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏食物，以防腸毒素形成； 在氣溫高的春夏季，食物置冷藏或通風(fēng)陰涼地方也不應(yīng)超過(guò)6小時(shí)，并且食用前要徹

7、底加熱。,檢測(cè)步驟-增菌,利用金黃色葡萄球菌耐鹽的特性（可耐受15%的氯化鈉），用含10%氯化鈉的胰酪胨大豆肉湯增菌。,檢測(cè)步驟-分離,血平板：金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生溶血素，因此在血平板上產(chǎn)生明顯的溶血環(huán)。 血平板上其典型菌落呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，有溶血圈。,檢測(cè)步驟-分離,BP平板： 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和痕量礦物元素 丙酮酸鈉是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑 亞碲酸鹽對(duì)除金黃色葡萄球外的其他能分解卵黃的菌株有毒性，并使菌落產(chǎn)生黑色 卵黃提供營(yíng)養(yǎng)和有利于觀察卵磷脂環(huán) 甘氨酸和氯化鋰對(duì)金黃色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,檢測(cè)步驟-分離,在

8、BP平板上其典型菌落為：圓形，光滑突起，濕潤(rùn)，直徑2-3mm，顏色呈灰色到黑玉色，邊緣常為淡色（米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色），周?chē)鸀橐换鞚釒?，在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹(shù)膠的粘稠感。 偶然會(huì)遇到不分解脂肪菌株，除無(wú)混濁帶及透明圈外，其他外觀基本相同。 長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落，其黑色常較典型菌落淡些，且外觀可能粗燥，質(zhì)地較干燥。,檢測(cè)步驟-鑒定,金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生凝固酶，因此對(duì)其鑒別的主要實(shí)驗(yàn)是測(cè)定其凝固酶。 對(duì)于凝固不完全的菌株，可以通過(guò)一些其他實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)，例如：厭氧葡萄糖發(fā)酵、溶葡萄球菌酶敏感性實(shí)驗(yàn)、耐熱核酸酶實(shí)驗(yàn)等。 所有這些實(shí)驗(yàn)不能作

9、為鑒別其產(chǎn)毒與否的依據(jù)。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?了解食品的質(zhì)量與金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的意義。 掌握金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性。 掌握金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的生化試驗(yàn)的操作方法和結(jié)果的判斷。 掌握食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的方法和技術(shù)。,二、原理 葡萄球菌在自然界分布極廣，空氣、土壤、水、飼料、食品(剩飯、糕點(diǎn)、牛奶、肉品等)以及人和動(dòng)物的體表粘膜等處均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬一個(gè)種?？梢鹌つw組織炎癥，還能產(chǎn)生腸毒素。如果在食品中大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素，人誤食了含有毒素的食品，就會(huì)發(fā)生食物中毒，故食品中存在金黃色葡萄球菌對(duì)人的健康是一種潛在危險(xiǎn)，檢查食品中金黃

10、色葡萄球菌及數(shù)量具有實(shí)際意義。 金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿凝固，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生溶血毒素，使血瓊脂平板菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應(yīng)。這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。,三、試劑和儀器 （一）最先準(zhǔn)備的器材 規(guī)格名稱(chēng)數(shù)量用途 1、500ml三角瓶1個(gè)7.5%氯化鈉肉湯 2、500ml三角瓶1個(gè)10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯 3、250ml三角瓶4個(gè)制血培養(yǎng)基等 4、10100mm試管6支血漿凝固酶試驗(yàn) 5、1ml移液管2支 6、10ml移液管2 支 7、直徑為90mm平皿 12套 制血平板、B-P平板 8、250ml量筒1支 （二）應(yīng)滅菌的其它器材 剪刀1把不銹鋼湯匙1

11、把 稱(chēng)量紙適量,（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基總量所用容器 7.5%氯化鈉肉湯 225ml/瓶1瓶 500ml三角瓶 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯 225ml/瓶1瓶 500ml三角瓶 血瓊脂 100ml/瓶1瓶 250ml三角瓶 BP培養(yǎng)基 95ml/瓶1瓶 250ml三角瓶 兔血液 5ml,A.1 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯,A.1.1 成分 胰酪胨（或胰蛋白胨） 17.0 g 植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3.0 g 氯化鈉 100.0 g 磷酸氫二鉀 2.5 g 丙酮酸鈉 10.0 g 葡萄糖 2.5 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.30.2 A.1.2 制法 將上述成分混合，加熱，

12、輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝，每瓶 225 mL，121 高壓滅菌 15 min。,A.2 7.5%氯化鈉肉湯,A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化鈉 75 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.4 A.2.2 制法 將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝，每瓶 225 mL，121 高壓滅菌 15 min。,A.3 血瓊脂平板,A.3.1 成分：豆粉瓊脂（pH7.47.6） 100 mL 脫纖維羊血（或兔血） 5 mL10 mL A.3.2 制法：加熱溶化瓊脂，冷卻至 50 ，以無(wú)菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。 血瓊脂平板：蛋白胨10g 牛肉膏5g 氯

13、化鈉5g 瓊脂1020g 蒸餾水1000ml 煮沸至充分溶解，高壓滅菌1520min 待冷卻至50 左右時(shí)加入50ml抗凝羊血（除去纖維）或兔血。搖勻或攪勻倒平板或試管斜面。 溫度過(guò)高，培養(yǎng)基呈棕褐色；溫度過(guò)低則不利于血液與培養(yǎng)基混勻。,A.4 BairdParker瓊脂平板,A.4.1 成分 胰蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 酵母膏 1.0 g 丙酮酸鈉 10.0 g 甘氨酸 12.0 g 氯化鋰（LiCl6H2O） 5.0 g 瓊脂 20.0 g 蒸餾水 950 mL pH 7.00.2 A.4.2 增菌劑的配法 30%卵黃鹽水 50 mL 與經(jīng)過(guò)除菌過(guò)濾的 1%亞碲酸鉀溶液 1

14、0 mL 混合，保存于冰箱內(nèi)。 A.4.3 制法 將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié) pH。分裝每瓶 95 mL，121 高壓滅菌 15 min。 臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷至 50 ，每 95 mL 加入預(yù)熱至 50 的卵黃亞碲酸鉀增菌劑 5 mL 搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過(guò) 48 h。 稱(chēng)取本品63 克,加入950ml蒸餾水中,加熱煮沸溶解，分裝,121高壓滅菌15分鐘備用。冷至50，每95ml加入預(yù)熱至50的卵黃亞碲酸鉀增菌液(04-025)配套試劑（用法與用量見(jiàn)配套試劑說(shuō)明）。搖勻后傾注平皿。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過(guò)

15、48h）,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 （一）、增菌培養(yǎng)法 樣品處理選擇性增菌選擇性平板分離血漿凝固酶試驗(yàn)鑒別結(jié)果報(bào)告,第一天 樣品處理和增菌培養(yǎng) （一）、樣品處理 固體或半固體食品：以無(wú)菌操作稱(chēng)取25g樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌均 質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)12min，制成1:10樣品勻液。 液體食品:：用滅菌吸管吸取25mL樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi) (瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖制成1:10樣品勻液。 （二）、增菌培養(yǎng) 接種操作：吸取5mL稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中。37C培養(yǎng)24小時(shí)。 培養(yǎng)：放于361培養(yǎng)24h。 培養(yǎng)結(jié)果：

16、在NaCl肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，胰蛋白胨肉湯中有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)。,第二天 接種選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng) （一）、接種選擇性平板 取增菌液1環(huán)，劃線接種于血平板或BP平板。 （二）、培養(yǎng) 放于361培養(yǎng)24h。,第三天 觀察分離結(jié)果、鏡檢、做血漿凝固酶試驗(yàn) （一）、觀察分離結(jié)果 結(jié)果：金黃色葡萄球菌，在血平板上呈：金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周?chē)腥苎Γ辉贐aird-Parker平板上：菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周?chē)幸粶啙釒В谄渫鈱佑幸煌该魅Α?（二）、革蘭氏染色、鏡檢 操作：革蘭氏染色鏡檢 結(jié)果：金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無(wú)芽胞，直

17、徑0.5-1m。 （三）、結(jié)果報(bào)告： 綜合形態(tài)特征，血平板情況以及血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果，判別檢樣有否金黃色葡萄球菌作出報(bào)告。,金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn),取肉湯培養(yǎng)物0.5mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿于試管內(nèi)充分混合,置 361培養(yǎng),定時(shí)觀察是否有凝塊形成,至少觀察6 h,以?xún)?nèi)容物完全凝固,使試管倒置或 傾斜時(shí)不流動(dòng)者為陽(yáng)性。,1支加入金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作陽(yáng)性對(duì)照， 另1支加入營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對(duì)照。,陽(yáng)性和陰性對(duì)照,血漿凝固酶試驗(yàn) (1)取潔凈玻片一張，于兩端各加兔血漿一滴。 (2)用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌苔一環(huán)，在玻片一端兔血漿

18、中研磨混勻，接種環(huán)滅 菌后再取白色葡萄球菌苔一環(huán)，在另一端兔血漿中研磨均勻。 (3)觀察兔血漿有無(wú)凝集現(xiàn)象。,四.檢驗(yàn)和控制1金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)樣品處理：無(wú)菌取25g或25mL食品樣品，放入225mL滅菌生理鹽水中均質(zhì)，制成10-1稀釋液。增菌培養(yǎng)：將10-1稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37C培養(yǎng)24小時(shí)。分離培養(yǎng)：將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37C培養(yǎng)24-48小時(shí)。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周?chē)腥苎?。在Baird-Parker平板上菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周?chē)幸粶啙釒А?染色觀察：從平板上挑取可疑性菌落進(jìn)行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無(wú)芽胞、莢膜，直徑0.5-1m。血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時(shí)培養(yǎng)物充分混勻，置361C培養(yǎng)，每隔半小時(shí)觀察一次，連續(xù)觀察6小時(shí)，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時(shí)，內(nèi)容物不流動(dòng)，判為陽(yáng)性。同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照。耐熱核酸酶試驗(yàn)：將24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種