1、基因多態(tài)性及其生物學(xué)作用和醫(yī)學(xué)意義 一、基因多態(tài)性：多態(tài)性（polymorphism）是指處于隨機(jī)婚配的群體中，同一基因位點(diǎn)可存在2種以上的基因型。在人群中，個(gè)體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因（DNA）的多態(tài)性(gene polymorphism)。這種多態(tài)性可以分為兩類，即DNA位點(diǎn)多態(tài)性(site polymorphism)和長(zhǎng)度多態(tài)性 (longth polymorphism)。1.位點(diǎn)多態(tài)性：是由于等位基因之間在特定的位點(diǎn)上DNA序列存在差異，也就是基因組中散在的堿基的不同，包括點(diǎn)突變（轉(zhuǎn)換和顛換），單個(gè)堿基的置換、缺失和插入。突變是基因多態(tài)性的一種特殊形式，單個(gè)堿基的置換又稱

2、為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP), SNP通常是一種二等位基因（biallelic）或二態(tài)的變異。據(jù)估計(jì)，單堿基變異的頻率在1/1000-2/1000。SNP在基因組中數(shù)量巨大，分布頻密，檢測(cè)易于自動(dòng)化和批量化，被認(rèn)為是新一代的遺傳標(biāo)記。2. 長(zhǎng)度多態(tài)性：一類為可變數(shù)目*重復(fù)序列（variable number of tandem repeats, VNTRS），它是由于相同的重復(fù)順序重復(fù)次數(shù)不同所致，它決定了小衛(wèi)星DNA（minisatellite）長(zhǎng)度的多態(tài)性。小衛(wèi)星是由15-65 bp的基本單位*而成，總長(zhǎng)通常不超過(guò)20bp，重復(fù)

3、次數(shù)在人群中是高度變異的。另一類長(zhǎng)度多態(tài)性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微衛(wèi)星DNA（microsatellite），它們是由重復(fù)序列*構(gòu)成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及(CGG)n等，通常重復(fù)10-60次。長(zhǎng)度多態(tài)性是按照孟德?tīng)柗绞竭z傳的，它們?cè)诨蚨ㄎ?、DNA指紋分析，遺傳病的分析和診斷中廣泛地應(yīng)用。造成基因多態(tài)性的原因：1復(fù)等位基因（multiple allele）位于一對(duì)同源染色體上對(duì)應(yīng)位置的一對(duì)基因稱為等位基因（allele）。由于群體中的突變，同一座位的基因系列稱為復(fù)等位基因。某些復(fù)合體基因的每一座位都存在為數(shù)眾多的復(fù)等位基因，這是某些復(fù)合體（HLA）高度多態(tài)性

4、的最主要原因。2共顯性（condominance）一對(duì)等位基因同為顯性，稱為共顯性，某些復(fù)合體中如HLA每一對(duì)等位基因勻?yàn)楣诧@性。共顯性大大增加了人群中某些基因表型的多樣化。基因的多態(tài)性顯示了遺傳背景的多樣性和復(fù)雜性。它可能是人類在進(jìn)化過(guò)程中抵御不良環(huán)境因素的一種適應(yīng)性表現(xiàn)，對(duì)維持種群的生存與延續(xù)具有重要的生物學(xué)意義。二、基因多態(tài)性的生物學(xué)作用：1遺傳密碼的改變：如果基因多態(tài)性的堿基的取代、缺失、插入引編碼序列的核苷酸順序改變，在轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)的過(guò)程中，有的對(duì)多肽鏈中氨基酸的排列順序產(chǎn)生影響，有的不產(chǎn)生影響。可分為：錯(cuò)義突變(missense mutation)指DNA分子中堿基對(duì)的取代

5、，使得mRNA的某一密碼子發(fā)生變化，由他所編碼的氨基酸就變成另一種不同的氨基酸，使得多肽鏈中氨基酸的順序也相應(yīng)地發(fā)生改變。無(wú)義突變(nonsense mutation)指由于堿基取代使原來(lái)可翻譯某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子。例如UAU（氨酸）顛換成UAA（終止密碼子）使多肽鏈的合成到此終止，形成一條不完整的多肽鏈，使蛋白質(zhì)的生物活性和功能改變。轉(zhuǎn)換也可引起無(wú)義突變。同義突變(same sense mutation)指堿基的取代并不都是引起錯(cuò)義突變和翻譯終止，也就是雖然堿基被取代了，但蛋白質(zhì)水平上沒(méi)有引起變化，氨基酸沒(méi)有被取代。移碼突變 (frame-shifting mutation)指

6、在編碼序列中單個(gè)堿基、數(shù)個(gè)堿基的缺失或插入，片段的缺失或插入可使突變位點(diǎn)之后的三聯(lián)體密碼子閱讀框發(fā)生改變，不能編碼原來(lái)的正常蛋白質(zhì)。2對(duì)mRNA剪接的影響：如果點(diǎn)突變發(fā)生內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)，可以產(chǎn)生兩種影響：一是原有的剪接位點(diǎn)消失，二是產(chǎn)生新的剪切位點(diǎn)。無(wú)論是那一種形式，都可以導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)誤剪接，產(chǎn)生異常的mRNA，最終產(chǎn)生異常的表達(dá)產(chǎn)物，數(shù)個(gè)堿基的缺失、片段缺失等勻有可能造成剪接位點(diǎn)的缺失。3蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失：無(wú)義突變和DNA片段的缺失都可以導(dǎo)致肽鏈中的片段缺失，致使基因編碼的蛋白質(zhì)失去原有的功能。移碼突變不僅翻譯后的肽鏈中氨基酸序列發(fā)生改變，而且也導(dǎo)致肽鏈中的大片段缺失。4啟動(dòng)子的

7、突變及非轉(zhuǎn)錄區(qū)的突變：可以使基因的轉(zhuǎn)錄水平或活性的增強(qiáng)或降低。5基因多態(tài)性的基因型頻率分布：在人群中符合Hardy-Wenberg平衡。三、基因多態(tài)性的醫(yī)學(xué)意義：人類基因多態(tài)性在闡明人體對(duì)疾病、毒物的易感性與耐受性，疾病臨床表現(xiàn)的多樣性（clinical phenotype diversity），以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性上都起著重要的作用。臨床上早期有關(guān)基因多態(tài)性的研究是從HLA基因開(kāi)始的，分析基因型在疾病發(fā)生易感性方面的作用，如HLA-B27等位基因與強(qiáng)直性脊椎炎發(fā)生率的密切關(guān)聯(lián)，可作為診斷的依據(jù)。通過(guò)基因多態(tài)性的研究，可從基因水平揭示人類不同個(gè)體間生物活性物質(zhì)的功能及效應(yīng)存在著差異的本質(zhì)。通

8、過(guò)對(duì)基因多態(tài)性與疾病的易感性的聯(lián)系研究，如P53抑癌基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究，可闡明人體對(duì)疾病、毒物和應(yīng)激的易感性，不僅為臨床醫(yī)學(xué)也為預(yù)防醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來(lái)新的領(lǐng)域。疾病基因多態(tài)性與臨床表型多樣性的聯(lián)系已受到重視，如腫瘤等多基因病的臨床表型往往多樣化，闡明基因型（genotype ）與表型(phenotype)之間的聯(lián)系在認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)生機(jī)理、預(yù)測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸等方面也有重要的作用。藥物代謝基因多態(tài)性可以影響藥物的代謝過(guò)程及清除率，從而影響治療效果。致病基因的多態(tài)性使同一疾病不同個(gè)體其體內(nèi)生物活性物質(zhì)的功能及效應(yīng)出現(xiàn)差異，導(dǎo)致治療反應(yīng)性上懸殊，按照基因多態(tài)性的特點(diǎn)用藥，將會(huì)使臨床治療符合個(gè)體

9、化的要求。在疾病基因多態(tài)性研究的引導(dǎo)下，臨床醫(yī)生將有可能預(yù)斷不同的個(gè)體在同樣的致病條件下會(huì)出現(xiàn)什么樣的病理反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，即臨床表型。如高血壓的治療將根據(jù)基因多態(tài)性的研究選擇更具針對(duì)性的藥物，調(diào)整其劑量，而不是不加選擇地使用ACEI、鈣拮抗劑或交感神經(jīng)受體阻斷劑。合并癥的防治也會(huì)更個(gè)體化，更具針對(duì)性?；蚨鄳B(tài)性的研究對(duì)于遺傳病具有雙重意義，一方面，基因的有害突變，不論是經(jīng)典的點(diǎn)突變，還是動(dòng)態(tài)突變，其本身就可能是遺傳病的病因，另一方面,眾多的多態(tài)性位點(diǎn)又是很好的遺傳標(biāo)記，可以在遺傳病的研究和臨床診斷中發(fā)揮重要的作用。1.多態(tài)性作為遺傳病的病因：點(diǎn)突變引起的疾?。簭溺牭稜罴?xì)胞貧血開(kāi)始，突變引起各種

10、遺傳病的例子愈來(lái)愈多，遺傳性腫瘤也逐漸被認(rèn)識(shí)。重復(fù)序列多態(tài)性作為遺傳病的病因：如CCG，CTG和CAG這樣的三核苷酸重復(fù)序列，當(dāng)其拷貝數(shù)過(guò)度增高時(shí)可以引起強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良等。三核苷酸拷貝數(shù)的擴(kuò)增或突變發(fā)生在世代傳遞過(guò)程中，由于拷貝數(shù)在世代間的改變，它被稱為動(dòng)態(tài)突變。目前動(dòng)態(tài)突變疾病大多是些神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，也有少數(shù)腫瘤。動(dòng)態(tài)突變疾病的發(fā)現(xiàn)提示序列拷貝數(shù)的多態(tài)性能夠成為遺傳病的病因。2.多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用：絕大多數(shù)DNA多態(tài)性并不引起遺傳病，但可作為遺傳標(biāo)記來(lái)使用。例如：上述提到的各種多態(tài)性標(biāo)記，包括RFLP位點(diǎn)，微衛(wèi)星和小衛(wèi)星DNA標(biāo)記都已廣泛用于遺傳病的連鎖診斷。利用各條染色體上位

11、置已知的眾多的多態(tài)性標(biāo)記，通過(guò)患病家系的連鎖分析，可以找到多基因病的致病基因或相關(guān)基因的位置，并為他們的分離克隆提供依據(jù)。此外，在疾病的關(guān)聯(lián)分析和病因?qū)W研究方面，通過(guò)比較患病群體和正常群體，可以發(fā)現(xiàn)兩組間多態(tài)性位點(diǎn)的特定等位基因頻率有顯著差別，則表明該位點(diǎn)與該疾病相關(guān)聯(lián)。使用多態(tài)性標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析既可以提示相關(guān)基因存在的位置，也有助于發(fā)病機(jī)理的闡明。基因多態(tài)性還可以用于疾病的分型與治療，即根據(jù)患者疾病多態(tài)性的基因型來(lái)解釋疾病的病因和臨床表現(xiàn)。在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，基因多態(tài)性的研究涉及的范圍廣泛，包括基因多態(tài)性與病因未知的疾病關(guān)系的研究，也包括對(duì)已知特定環(huán)境因素致病易感基因的篩選。由于基因多態(tài)性有明顯的

12、種族差異，因此在基因-環(huán)境交互作用模式上，不同的種族之間有可能不同。所以，開(kāi)展我國(guó)人群的基因多態(tài)性與環(huán)境的作用關(guān)系的研究具有重要的意義。而基因多態(tài)性的研究在職業(yè)病醫(yī)學(xué)中則更具有實(shí)際的意義。對(duì)易感基因和易感性生物標(biāo)志物的分析，將某些攜帶敏感基因型的人甄別開(kāi)來(lái)，采取針對(duì)性預(yù)防措施，提高預(yù)防職業(yè)性危害工作的效率。對(duì)特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多態(tài)性研究，有助于闡明環(huán)境因素的致病機(jī)制，也推動(dòng)了遺傳易感性標(biāo)志物的研究。四、基因多態(tài)性的檢測(cè)方法：1限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態(tài)性，致使DNA 分子

13、的限制酶切位點(diǎn)及數(shù)目發(fā)生改變，用限制酶切割基因組時(shí)，所產(chǎn)生的片段數(shù)目和每個(gè)片段的長(zhǎng)度就不同，即所謂的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，導(dǎo)致限制片段長(zhǎng)度發(fā)生改變的酶切位點(diǎn)，又稱為多態(tài)性位點(diǎn)。最早是用Southern Blot/RFLP方法檢測(cè)，后來(lái)采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）與限制酶酶切相結(jié)合的方法?，F(xiàn)在多采用PCR-RFLP法進(jìn)行研究基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。2單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）：是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別的點(diǎn)突變檢測(cè)方法。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，就會(huì)形成不同的構(gòu)象。在電泳時(shí)泳動(dòng)的速度不同。將PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后，進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時(shí)，靶DNA中若發(fā)生單個(gè)堿基替換等

14、改變時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位（mobility shift），多用于鑒定是否存在突變及診斷未知突變。3PCR-ASO探針?lè)ǎ≒CR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)?。在PCR擴(kuò)增DNA片段后，直接與相應(yīng)的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交，針對(duì)每種突變分別合成一對(duì)寡核苷酸片段作為探針，其中一個(gè)具有正常序列，另一個(gè)則具有突變堿基。突變堿基及對(duì)應(yīng)的正常堿基勻位于寡核苷酸片段的中央，嚴(yán)格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補(bǔ)的等位基因片段才顯示

15、雜交信號(hào)，而與探針中央堿基不同的等位基因片段不顯示雜交信號(hào)，如果正常和突變探針都可雜交，說(shuō)明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說(shuō)明突變基因?yàn)榧兒献?，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應(yīng)的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。4. PCR-SSO法：SSO技術(shù)即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段擴(kuò)增后利用序列特異性寡核苷酸探針，通過(guò)雜交的方法進(jìn)行擴(kuò)增片段的分析鑒定。探針與PCR產(chǎn)物在一定條件下雜交具有高度

16、的特異性，嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)的原則。探針可用放射性同位素標(biāo)記，通過(guò)放射自顯影的方法檢測(cè)，也可以用非放射性標(biāo)記如地高辛、生物素、過(guò)氧化物酶等進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記物檢測(cè)。5. PCR-SSP法：序列特異性引物分析即根據(jù)各等位基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)出一套針對(duì)每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性 (group-specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。SSP只能與某一等位基因特異性片段的堿基序列互補(bǔ)性結(jié)合，通過(guò)PCR特異性地?cái)U(kuò)增該基因片段，從而達(dá)到分析基因多態(tài)性的目的。6. PCR-熒光法：用熒光標(biāo)記PCR引物的5端，熒光染料FAM和JOE呈綠色熒光，TAMRA呈

17、紅色熒光，COUM 呈蘭色熒光，不同熒光標(biāo)記的多種引物同時(shí)參加反應(yīng)，PCR擴(kuò)增待檢測(cè)的DNA，合成的產(chǎn)物分別帶有引物5端的染料，很容易發(fā)現(xiàn)目的基因存在與否。7. PCR-DNA測(cè)序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由于PCR技術(shù)的應(yīng)用，使得DNA 測(cè)序技術(shù)從過(guò)去的分子克隆后測(cè)序進(jìn)入PCR直接測(cè)序。PCR產(chǎn)物在自動(dòng)測(cè)序儀上電泳后測(cè)序。常用方法有：Sanger雙脫氧末端終止法;Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法；DNA測(cè)序的自動(dòng)化。目前DNA順序全自動(dòng)激光測(cè)定法是最先進(jìn)的方法。8. PCR指紋圖法（PCR-fingerprints）：實(shí)用于快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個(gè)體中，每種DR單倍型及每種單倍型組合所產(chǎn)生的單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的大小、數(shù)目和位置各異，由于同質(zhì)雙鏈和異質(zhì)雙鏈之間的分子構(gòu)象不同。因此，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它們的遷移率各不相同，從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針，同經(jīng)過(guò)酶切的人體DNA作Southern blot，可以得出長(zhǎng)度不等的雜交帶，雜交帶的數(shù)目和分子量的大小具有個(gè)體特異性，除非同卵雙生，幾乎沒(méi)有兩個(gè)人是完全相同的，