1、概述 細(xì)胞凋亡過程與機(jī)制 細(xì)胞凋亡與疾病 細(xì)胞凋亡的檢測,第八章 細(xì)胞凋亡,1,概述,2,一、細(xì)胞死亡的模式, Necrosis = 細(xì)胞病理性死亡 Apoptosis = 細(xì)胞自發(fā)性死亡,壞死,凋亡,3,apoptosis,4,Concept of apoptosis: 體內(nèi)外生理或病理因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)死亡程序細(xì)胞死亡,5,細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡的區(qū)別,6,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別 特征 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死 誘導(dǎo)因素 生理及弱刺激 強(qiáng)烈刺激 受累范圍 單個(gè)細(xì)胞丟失 成群細(xì)胞死亡 膜完整性 保持到晚期 早期即喪失 細(xì)胞體積 減小、固縮 增大腫脹 染色質(zhì) 凝聚成半月形 稀疏成網(wǎng)狀 細(xì)胞器 無明顯變化

2、腫張破壞 溶酶體 保持完整 破壞外溢 細(xì)胞形狀 形成凋亡小體 破裂成碎片 基因組DNA 有控降解 隨機(jī)降解 大分子合成 一般需要 不需要 基因調(diào)控 有 無 后果 不引起炎癥反應(yīng) 引起炎癥反應(yīng) 意義 生理死亡方式 病理死亡方式,7,凋亡的生理學(xué)意義: 胚胎發(fā)育期去除某些細(xì)胞 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 增殖細(xì)胞群中細(xì)胞去除、去除潛在有害的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞 參與防御反應(yīng) 細(xì)胞毒T細(xì)胞 凋亡過多或不足疾?。?腫瘤、艾滋病、神經(jīng)變性性疾病、缺血性損傷,8,二 、凋亡時(shí)細(xì)胞的主要變化,1. 形態(tài)學(xué)改變 （The morphologic characteristics of apoptosis） 凋亡細(xì)胞（實(shí)體細(xì)胞

3、）與周圍細(xì)胞脫接觸 胞膜空泡化（Blebbing） 細(xì)胞固縮（Condensation）、核固縮和發(fā)芽 凋亡小體（Apoptotic small body）,9,細(xì) 胞 凋 亡,10,(掃描電鏡) 正常細(xì)胞,(掃描電鏡) (透射電鏡) 凋亡細(xì)胞凋亡小體,11,DNA片斷化,caspase激活,滅活凋亡抑制物,水解活性蛋白,水解結(jié)構(gòu)蛋白,Ca 2+ /Mg 2+ Zn 2+,2. 生化改變 （The biochemical characteristics of apoptosis）,鈣超載,12,DNA片段化 （DNA ladding pattern）,核酸內(nèi)切酶激活 核小體連接區(qū)DNA降解 1

4、80200bp整數(shù)倍的DNA片段,13,細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻,14,凋亡的過程及機(jī)制,凋亡誘導(dǎo)因素,死亡信號,巨噬細(xì)胞吞噬分解凋亡細(xì)胞,15,凋亡的機(jī)制,16,細(xì)胞凋亡的兩條通路：死亡受體途徑、線粒體途徑,17,（1）死亡受體途徑 （death receptor pathway）,死亡受體（death receptor, DR） 腫瘤壞死因子受體超家族成員，跨膜蛋白，與相應(yīng)配體結(jié)合傳遞細(xì)胞信號 Fas(CD95), TNFR1, RAIL-R2/DR5,18,參與死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白： 死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（ death domain protein, DD） TRADD：TNF受體相關(guān)死亡

5、結(jié)構(gòu)域蛋白 TNF + TNFR1（死亡結(jié)構(gòu)域）+ TRADD 細(xì)胞凋亡 FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 FasL + Fas （死亡結(jié)構(gòu)域） +FADD 細(xì)胞凋亡,19,FasL + Fas 凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物（DISC） FADD（C端DD結(jié)構(gòu)域與Fas胞內(nèi)段結(jié)合 N端DED結(jié)構(gòu)域與無活性caspase8酶原交聯(lián)） caspase8酶原聚集到復(fù)合物上 一系列caspase激活 細(xì)胞凋亡,20,FADD（Fas-associated death domain） DD（death domain） DED （death effector domain）,FSAL,FADD,Pro-caspase

6、-8,Caspase-8,Caspase-3,Pro-caspase-3,Fas,DED,DED,DD,21,22,（2）線粒體途徑,線粒體釋放細(xì)胞色素C 細(xì)胞凋亡 PT孔開放線粒體跨膜電位，細(xì)胞色素C釋放 促凋亡蛋白Bax促PT孔開放 抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl抑制PT孔開放,23,細(xì)胞色素C + Apaf-1 + caspase9前體凋亡體 召集并激活caspase3 細(xì)胞凋亡 Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子,24,線粒體途徑 （ mitochondrial pathway）,25,Caspase依賴的細(xì)胞凋亡（Caspase-dependent apoptosis）,Caspa

7、se特點(diǎn)： -以酶原的形式存在 -酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性 -水解天冬氨酸C端肽鍵 故稱 Caspases (Cysteine，aspartic acid，protease),26,Caspase家族的分類 凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶： Caspase8， Caspase 9，Caspase10 凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶： Caspase3， Caspase6， Caspase7 ICE(interlukin-1converting enzyme)亞類Caspase蛋白酶：參與炎癥反應(yīng) Caspase1，Caspase4， Caspase5， Caspase11, Cas

8、pase12， Caspase13， Caspase14,27, Caspase通路分類,啟動亞類（Caspase -8 , -9, -10） 效應(yīng)亞類（Caspase -3, -6, -7）, Caspase,死亡受體途徑 線粒體途徑,28,29,Caspase可激活CAD (caspase-activated DNase)核酸酶，該酶在核小體的連接區(qū)將DNA切斷，形成約200bp整倍數(shù)的核酸片段 正常情況下， CAD與抑制物ICAD-DFF-45結(jié)合，存在于胞質(zhì)中，無活性 Caspase活化后降解抑制物ICAD， CAD激活并入核降解DNA使其片段化,30,Pro-caspase-9,ca

9、spase-9,Effector caspase,Caspase-3,Pro-caspase-3,31,Caspase的作用,32,Caspase非依賴的細(xì)胞凋亡 （Caspase-independent apoptosis） 凋亡誘導(dǎo)因子（AIF） 線粒體蛋白AIF釋放到胞質(zhì)內(nèi)與抑制凋亡的因 子結(jié)合，從而促發(fā)凋亡 鈣超載,33,鈣超載引起凋亡機(jī)制,胞漿Ca2+ ,激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄 激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈 激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，使細(xì)胞骨架分解凋亡小體,細(xì)胞凋亡,34,細(xì)胞凋亡的調(diào)控,凋亡相關(guān)因素 凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo) 凋亡相關(guān)基因,35,1、影響細(xì)胞

10、凋亡的因素,36,2、凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn),多樣性：不同種類細(xì)胞有不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) 偶聯(lián)性：死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與細(xì)胞增殖、分化過程 中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在一些環(huán)節(jié)上交叉、偶聯(lián) 同一性：不同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系 統(tǒng)引起細(xì)胞凋亡 多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可經(jīng)過多條信號途徑觸 發(fā)細(xì)胞凋亡,37,3、細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因 （Regulated mechanism of apoptosis）,38,Bcl-2基因 （B cell lymphoma/leukemia-2） 廣泛存在于造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及多種瘤細(xì)胞 Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個(gè)成員，可分為3個(gè)亞族： Bcl-2亞家族：

11、抑制細(xì)胞凋亡 Bax亞家族：促進(jìn)細(xì)胞凋亡 BH3亞家族：促進(jìn)細(xì)胞凋亡,39,40,Bcl-2抑制凋亡機(jī)制： 抑制線粒體PT孔開放，Cyt.c 、AIF釋放 結(jié)合和滅活A(yù)paf-1，阻斷caspase-9活化 特異性結(jié)合細(xì)胞色素C 維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài),41,c-myc, bcl-x,促進(jìn)增殖 c-myc(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子) 誘導(dǎo)凋亡 Bcl-XL 抑制凋亡 Bcl-x Bcl-Xs 促進(jìn)凋亡,GF,42,p53促凋亡機(jī)制： - 與Bcl-2基因相互作用，下調(diào) Bcl-2的表達(dá) - 誘導(dǎo)線粒體內(nèi)凋亡的相關(guān)蛋白（Bax等）表達(dá)，并觸發(fā)細(xì)胞色素C釋放和caspase活化 - 誘導(dǎo)死亡受體Fas表達(dá),43,C-

12、myc雙向調(diào)控凋亡,調(diào)控細(xì)胞周期基因，編碼的蛋白是DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。 GF充足時(shí)主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因 GF不足時(shí)激活凋亡基因,44,凋亡與疾病,（Diseases associated to apoptosis）,45,（一）細(xì)胞凋亡不足（Apoptosis inhibition） 1. 腫瘤（Tumor）, bcl-2基因過表達(dá) 85%濾泡狀和20%彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤 染色體 t（14;18）易位 IgH基因與bcl-2基因拼接 bcl-2基因活化 細(xì)胞凋亡速率 腫瘤發(fā)生 （乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等也存在Bcl-2高表達(dá)）,46, p53基因缺失或突變 p53的

13、穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)定位或（和）活性異常 p53表達(dá)或功能缺陷 細(xì)胞凋亡率 腫瘤發(fā)生,病毒的癌基因 HBV編碼的HBX是Caspase-3的強(qiáng)效抑制物，與肝癌發(fā)生密切相關(guān),47,異常融合蛋白 慢性髓細(xì)胞性白血?。–ML） 染色體易位 t (9；22) Bcr-abl融合基因（p210 Bcr-abl蛋白質(zhì)） NF-B活化、細(xì)胞凋亡速率 髓系祖細(xì)胞的克隆擴(kuò)增 腫瘤發(fā)生,48,2自身免疫?。ˋutoimmune diseases） 針對自身抗原的免疫細(xì)胞未被及時(shí)清除，機(jī)體產(chǎn)生針對自身抗原的體液免疫和細(xì)胞免疫，導(dǎo)致器官組織損傷。,49,（二）細(xì)胞凋亡過度（Apoptosis excess） 1.心肌缺血與

14、缺血-再灌注損傷 特點(diǎn) 缺血早期以凋亡為主，晚期以細(xì)胞壞死為主。 在梗死灶的中心以壞死為主，梗死灶周邊以凋亡為主； 輕度缺血以凋亡為主，重度缺血以壞死為主； 機(jī)制 氧化應(yīng)激 Fas通路 p53基因轉(zhuǎn)錄增加,50,細(xì)胞凋亡在疾病防治中的意義 合理利用凋亡相關(guān)因素 1.誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡 放療、化療 高熱、高溫 2.減少細(xì)胞凋亡 ： NGF、促生長因子、抗氧化劑,抑制Bcl-2抗凋亡作用 促進(jìn)促凋亡基因作用 增強(qiáng)P53促凋亡作用,51, 干預(yù)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因 控制凋亡相關(guān)酶學(xué)機(jī)制 防止線粒體跨膜電位的下降,52,細(xì)胞凋亡的檢測,1、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測 2、磷脂酰絲氨酸外翻分

15、析（Annexin V法） 3、線粒體膜勢能（mt）的檢測 4、DNA片斷化檢測 5、TUNEL法 6、Caspase-3活性的檢測 7、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的表達(dá)和細(xì)胞定位分析,53,1、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測,光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞V變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期可見凋亡小體。 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡 一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst

16、33258; DAPI。 電子顯微鏡觀察,54,Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm 400）,55,電鏡觀察 凋亡細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮。凋亡期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多空泡結(jié)構(gòu)。IIa染色質(zhì)高度凝集、邊緣化。凋亡晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。,56,流式細(xì)胞術(shù)檢測：,57,2、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）,Phosphatidylserine(PS) 正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到膜表面 Annexin-V： Ca2+依賴性磷脂結(jié)合

17、蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、R-PE）標(biāo)記后作為探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。,58,2、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）,59,60,61,62,Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV + PI,63,3、線粒體膜勢能（mt）的檢測,線粒體熒光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。,64,4、DNA片段化分析,細(xì)胞凋亡時(shí)染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。,65,5