1、線蟲的EMS誘變和突變體篩選摘要：秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一種被廣泛研究的模式生物，其性狀容易辨別，突變型多且容易獲得。本實驗用EMS誘變劑對同步化后的N2型懷卵成蟲線蟲進行不定向誘變，篩選出一系列的突變體，再通過對親代突變體的子代進行進一步的篩選，篩選出F1、F2、F3突變體，最后獲得性狀穩(wěn)定的、能夠穩(wěn)定遺傳的突變體，可以將突變體至于-80保存。本次試驗涉及到的生物技術有：無菌操作技術，同步化技術，EMS誘變技術，顯微操作技術等。將獲得的突變體與野生型作對比，可以在顯微鏡下觀察到性狀明顯的突變體，將突變體轉移、傳代、保留，最后獲得穩(wěn)

2、定的突變體。關鍵詞：秀麗隱桿線蟲同步化 EMS誘變無菌操作技術突變體1.引言秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一種以細菌為食，居住在土壤中，無毒無害、可以獨立生存的線蟲。它有如下幾個特點：其個體小，成體僅1mm長，雌雄同體全身共有959個細胞，雄性線蟲全身共有1031個體細胞；為雌雄同體：雄性個體僅占群體的0.2%，可自體受精或雙性生殖；染色體組簡單：只有5對常染色體和1對性染色體；基因組便于研究：基因組大小僅為100Mb，并且內含子少，基因密度高；生活周期短且隨溫度變化：線蟲整個的生命周期僅3天（25）。野生型線蟲胚胎發(fā)育中細胞分裂和細胞系的

3、形成具有高度的程序性，這樣就便于對其發(fā)育進行遺傳學分析。溫度越高，生活周期越短；有大量突變株；繁殖能力強：成蟲一生可產(chǎn)300個受精卵；易于保存：可以用-80冰箱長期保存線蟲作為模式生物，與酵母、果蠅、斑馬魚、小鼠和擬南芥等一起，為生命科學的發(fā)展做出了極大的貢獻。它與其他模式生物相比，有自身優(yōu)勢，如：它只有消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，并且肉眼可見，容易研究；它是目前最適合大規(guī)模藥物篩選的多細胞動物，它的研究成本低：既提供了一個完整動物實驗系統(tǒng)，又避免了小鼠模型的高價費時等。但也有其缺點，如：線蟲的神經(jīng)元細胞對 RNAi不敏感；線蟲沒有心臟、獲得性免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等，所以一些人類疾病無法在線蟲中模擬；鑒

4、于線蟲與人類種間距離太遠，線蟲的作用仍是在藥物研發(fā)初期，快速粗篩，提供線索，需要再經(jīng)過哺乳動物模型的“細篩”?；诰€蟲的自身體積小并且結構簡單的優(yōu)勢，國內外眾多的科研機構都在以線蟲作為研究材料，在RNAi、衰老、藥物篩選、功能基因組學等領域進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，線蟲中大約有35%的基因是在人體中具有等同作用，并且有大量人類遺傳疾病同源基因，只有大約58%是線蟲特有的，所以，從理論上講, 只要人類疾病的靶蛋白或調控途徑是物種間保守的, 就可能利用模式生物來進行研究。目前，已經(jīng)有許多成功的線蟲病理模型，如：溶酶體病，阿爾茨海默癥 (Alzheimers, AD)，多囊腎病 (polycystic k

5、idney disease)，Duchenne 肌營養(yǎng)不良癥，過氧化物體生物合成缺陷等。甲基磺酸乙酯，簡稱EMS，是一種重要的致癌物之一，生物學上可以用來創(chuàng)建突變體庫。本實驗就是將EMS作為誘變劑來獲得線蟲的突變體。線蟲有單基因突變形成的表型，例如：運動不協(xié)調（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成這些表型的基因有很多個，分別分布于各條染色體上。這些易于觀察的表型作為遺傳標記，給線蟲的經(jīng)典遺傳學實驗帶來了極大的便利。此外，線蟲還有許多組織特異性標記的品系，如在線蟲中負責協(xié)調前后運動的D型運動神經(jīng)元。我們通過對排卵時期的線蟲進行誘

6、變，觀察誘變后線蟲突變體表形，對突變體后代進行篩選，探究影響突變型基因的顯隱性，最終獲得能夠穩(wěn)定遺傳的突變體。2.材料和方法2.1 材料、試劑和器材實驗材料：N2型秀麗隱桿線蟲。實驗試劑：NGM（Nematode Growth Media）固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、M9線蟲生理溶液。實驗器材：培養(yǎng)皿、報紙、錐形瓶（500ml、300ml、100ml）、15ml離心管、藍槍尖、黃槍尖、Ep管、5ml的塑料試管、高壓蒸汽滅菌鍋、離心機、酒精燈、移液槍（1000ml、200ml）。2.2 方法2.2.1儀器的洗滌、包裝與滅菌，相關溶液的配制。（1）儀器的洗滌與包裝用自來水洗滌55mm培養(yǎng)皿（我們組

7、一次性洗12個培養(yǎng)皿），晾干后用報紙包裝好，以待滅菌。洗滌500ml錐形瓶，300ml錐形瓶，100ml錐形瓶，15ml離心管若干，錐形瓶裝入液體后，用錫紙封口，15ml離心管用報紙包好，以待滅菌。將藍槍尖和黃槍尖塞入槍尖盒，用報紙包裝好以待滅菌。將Ep管和5ml的塑料試管管放入玻璃瓶中，用報紙封口，以待滅菌。（2）相關溶液的配制NGM（Nematode Growth Media）固體培養(yǎng)基的配置按表1配置NGM固體培養(yǎng)基表1NGM固體培養(yǎng)基的配方NGM固體培養(yǎng)基150ml400mlNaCl0.45g1.2gagar2.6g6.8gtyptone0.375g1.000gdH2O146ml390

8、ml120滅菌15分鐘，然后在無菌的條件下加入下列滅菌的溶液CaCl2(1M)0.15ml0.40mlMgSO4(1M)0.15ml0.40ml磷酸緩沖液(1M)Ph63.75ml10ml膽固醇（1.5g/ml）0.15ml0.40mlLB液體培養(yǎng)基的配置按表2配置LB液體培養(yǎng)基表2LB液體培養(yǎng)基的配方LB液體培養(yǎng)基200mltyptone2gyeast1gNaCl1gdH2O200ml 120滅菌15分鐘M9線蟲生理溶液的配置按表3配M9線蟲生理溶液表3 M9線蟲生理溶液的配方M9線蟲生理溶液500mlKH2PO41.5gNa2HPO4,3gNaCl2.5gdH2O500ml 120滅菌15

9、分鐘MgSO4(1M)0.5ml(3)儀器與溶液的滅菌打開高壓蒸汽滅菌鍋，設置滅菌溫度120和滅菌時間10分鐘，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥，高壓鍋繼續(xù)升溫，自動滅菌。在壓力降到0.5MPa，可緩慢放出蒸氣。當壓力降到零后，才能開蓋，取出滅菌物品。2.2.2傾倒NGM平板，搖菌與鋪板（1）傾倒NGM平板紫外滅菌無菌操作臺5分鐘。雙手用酒精消毒之后，點燃酒精燈。待固體培養(yǎng)基冷卻至60，在酒精燈附近逐一傾倒平板，保證每個平板有NGM固體培養(yǎng)基約10ml。在培養(yǎng)皿皿蓋上做好標記（包括組名，日期），待NGM固體培養(yǎng)基冷卻后，如果不用菌液鋪板，就用

10、封口膜封口后倒置于4冰箱保存，如果菌液已經(jīng)活化，則可直接鋪板。（2）菌種的活化與鋪板紫外滅菌無菌操作臺5分鐘。雙手用酒精消毒之后，點燃酒精燈。取出兩管高壓后的15ml離心管，用移液槍吸取液體配養(yǎng)基3ml,加入原始的OP50菌液300l，過夜搖菌。取200300l活化的菌液均勻地鋪在NGM固體培養(yǎng)基里，用手搖動晃勻菌液，封口膜封口后，平置于操作臺上待菌液被吸收。等菌液被NGM固體培養(yǎng)基吸收后（一般20分鐘），在37培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，等細菌長出薄薄的一層（一般12-24hr）即可接線蟲或倒置放在4冰箱保存。搖菌剩余的菌種可以與甘油1比1混合，顛倒搖勻，至于-20保存。2.2.3.懷卵成蟲的同步化（1

11、）選擇一個含有大量懷卵成蟲的培養(yǎng)皿，用3mlM9洗下，放入5ml的塑料試管，加入0.8ml20%次氯酸鈉，0.4ml0.5M的NaOH（事先配置次氯酸鈉和NaOH各1ml）。10min后，蟲體破裂，溶液變澄清。（2）3000轉離心1min，棄上清。（3）4mlM9，混勻，3000rpm，離心1min，棄上清。（4）重復步驟（3）23次以去除殘留的裂解液。（5）加入0.2ml M9，混勻。（6）將液體接種于NGM上，20培養(yǎng)，約56hr達到L4或20培養(yǎng)24hr,轉至25培養(yǎng)大約21-22hr達到L4。2.2.4.EMS誘變和突變體篩選（1）無菌條件下，將培養(yǎng)皿中處于L4早期的雌雄同體線蟲用5m

12、l M9懸浮，用移液器轉移至無菌離心管中。（2）1000rpm離心30s，去除上清，加入2mL M9。（3）另取一只離心管，加入M9 2ml以及20l EMS，擰緊蓋子，振蕩混勻。（4）2mL 含線蟲M9倒入2mL 含EMS M9 中，混勻，用封口膜密封。（5）室溫放置45 h，混勻30min。（6）1000rpm離心30s，去除上清，加入3-4mL M9清洗。（7）重復（6）34次。（8）自然沉淀，去上清，留下1mL 連同蟲子轉入NGM板上,每一個NGM板上加200ul，20培養(yǎng)2天后至產(chǎn)卵，移去成蟲；（9）繼續(xù)20培養(yǎng)若干天后連續(xù)觀察，篩選能夠穩(wěn)定遺傳的突變體及突變體的子代。3.結果在4（

13、或10）顯微鏡下觀察到的線蟲突變體和對照組如圖所示。3112111113.1運動軌跡變化突變體411511圖一 運動軌跡變化突變體的篩選圖一所示的是運動軌跡變化的突變體。圖1是野生型線蟲的運動軌跡，設為對照組，圖2至圖5是突變后線蟲的運動軌跡，設為實驗組。圖2的運動軌跡較野生型相比更為平緩，圖3的運動軌跡較野生型相比更為陡峭，而圖4突變體的運動軌跡呈麻花狀，圖5突變體的運動軌跡極不規(guī)則并且十分糾結。這些都是可能是線蟲的突變體，但我們發(fā)現(xiàn)運動軌跡奇怪的突變體的子代軌跡又往往正?；?，我們做了如下推測：運動軌跡的突變體是不可遺傳的，表現(xiàn)為運動軌跡突變體可能是由環(huán)境決定的，或者是線蟲發(fā)生體細胞突變引

14、起的；運動軌跡的突變體發(fā)生的突變可能是隱形突變，因此在后代所占比例太少，而且運動軌跡在蟲子太多的時候又難以觀察，所以難以獲得穩(wěn)定的運動軌跡奇怪的穩(wěn)定遺傳的突變體；運動軌跡奇怪的線蟲本身并沒有發(fā)生突變，可能是由于自身興奮而產(chǎn)生了奇怪的運動軌跡。6543213.2形態(tài)特征變化突變體圖二形態(tài)特征變化突變體的篩選圖二是形態(tài)特征變化的突變體。圖1是野生型成體期線蟲的形態(tài)特征，設為對照組，圖2至圖6是突變后線蟲的形態(tài)特征，設為實驗組。圖2是嚴重卷曲，極少移動的成體期線蟲突變體，圖3是背部長小泡的成體期線蟲突變體，圖4是身體細長，并且頭尾很尖的L4期線蟲突變體，圖5是短粗的成體期線蟲突變體，圖6是只能向左轉

15、彎的成體期運動障礙突變體。其中，在這幾種突變體中，身體細長，并且頭尾很尖的突變體和向左轉彎的運動障礙突變體是可遺傳的顯性突變體，其他幾種突變體的后代都是野生型形態(tài)的線蟲，不是穩(wěn)定的突變體。4.討論（1）使用高壓蒸汽滅菌鍋時，一開始當壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后（也可以在5分鐘之后），再關閉放氣閥，以完全排除鍋內空氣，使滅菌才能徹底。（2）滅菌完后，如果時間緊急，可在壓力降到0.5MPa，可緩慢放出蒸氣。當壓力降到零后，才能開蓋，取出滅菌物品。（3）所配置的液體培養(yǎng)基高壓后要分裝在幾個小量程的錐形瓶中，這樣如果操作過程中液體培養(yǎng)基被污染，可防止配置的液體培

16、養(yǎng)基全被污染。（4）搖菌的時候一種菌搖兩管，這樣可以保證如果一管菌的菌種引入了雜菌，另一管菌液如果沒被污染就還能用。（5）無菌操作臺在使用前應該先紫外滅菌5分鐘，操作之前雙手也應該用酒精消毒，以防止操作過程中造成實驗污染。（6）細菌要倒置培養(yǎng)，防止水蒸氣滴到固體培養(yǎng)基上，影響微生物的生長、線蟲的運動和雜菌污染。（7）在用菌液鋪板時，如果培養(yǎng)的是野生型線蟲，為了讓線蟲均勻地在培養(yǎng)基上大量生長，需要均勻地鋪板，如果是觀察誘變體，則將菌液集中滴在中間，使線蟲集中生長，利于觀察突變體。（8）在做同步化的時候，一定要觀察到培養(yǎng)皿上有大量化卵成蟲再做同步化，不然得到的同步化的蟲子會特別少。（9）如果同步化

17、得到的蟲子很少，有兩種方法補救：找一個含有大量化卵成蟲的皿再做同步化；在野生型線蟲培養(yǎng)基上選取一塊線蟲生長時期相同的區(qū)域，挖下來，接到新的培養(yǎng)基上，多挖幾塊繼續(xù)培養(yǎng)，這樣數(shù)小時后得到的蟲子基本還應該是同一時期的。在做同步化的時候可以多同步化幾個板，這樣如果一個板同步化失敗了，還會有一個板可以補救。（10）誘變過程中一定要將EMS洗干凈，否則誘變時間太長，線蟲會死掉。（11）一定要讓菌在37培養(yǎng)箱里鋪滿再接線蟲(一般616個小時)，否則容易在挑突變體的過程中造成雜菌污染，如果op50在培養(yǎng)基上長滿了，就會形成優(yōu)勢菌種，這樣就很難造成雜菌污染。（12）當菌長滿培養(yǎng)皿的時候，若不立即接種，可以在4倒

18、置放置一段時間，但不要放置時間過長，原因如下：菌的壽命也有限，時間越長，菌的活性越低；菌的尸體會影響對線蟲的觀察。（13）Op50所生長的NGM固體培養(yǎng)基是沒有加氨芐的，操作不當容易長菌。長菌的板容易使線蟲誘變，所以在超凈臺上操作的時候一定要注意不要污染。（14）在找突變體之前可以先觀察突變體線蟲的樣板，對照著樣板的突變體找誘變的突變體，找到突變體之后再將其與野生型突變體對比，以確認找到的突變體是否典型。（15）找突變體的時候在解剖鏡下找，這樣好挑線蟲，挑線蟲的時候要用灼燒過又冷卻至室溫的的pick挑，以免污染培養(yǎng)基。觀察突變體線蟲的時候在顯微鏡下觀察。（16）剛從培養(yǎng)箱或冰箱里拿出來的培養(yǎng)基

19、上可能有少許水，可先將其在桌面上倒置一會兒再使水流到培養(yǎng)皿皿蓋，然后再用火烤烤皿蓋將水烤干，倘若培養(yǎng)皿上水汽太多，剛剛接入的線蟲會成游泳狀運動，讓人誤以為是突變體。（17）整個實驗過程中要估計好線蟲生長時間，在20，線蟲的生長周期大約是4天，如果沒有及時挑突變體，可以根據(jù)線蟲的生長周期推斷挑的突變體是F1代突變體還是F2代突變體等，不過這種方法也不能保證誘變的培養(yǎng)基中的突變體是第幾代，因為基因突變也可以是自發(fā)產(chǎn)生的。因此，培養(yǎng)基一定要事先配好，不要誤了挑選突變體的時間，這樣才能一步步地篩選能夠穩(wěn)定遺傳的突變體。（18）挑完突變體一定要找同時期的野生型線蟲在同一顯微鏡下作對比，這樣可以確保找到的

20、突變體是否真的與野生型不同，在進行對比的時候不要反復地調節(jié)細準焦螺旋，因為在調節(jié)細準焦螺旋的時候會產(chǎn)生視覺誤差，就算是同一只線蟲在轉換細準焦螺旋觀察的時候也會覺得粗細有所變化。（19）在觀察運動障礙的突變體時，只有細心觀察才能找到運動障礙的突變體，我們找到的只能向左轉彎的運動障礙突變體就需要長時間的觀察才能找到，它的頭部總是在搖擺，當感覺要向右運動時就突然停止運動，而是向后退，但是大多數(shù)情況，這種線蟲會向左運動。（20）長菌的培養(yǎng)皿容易誘變出氣泡的突變體，由于這種形狀是環(huán)境誘導的，很可能是不可遺傳的突變，因此，長泡線蟲的后代幾乎觀察不到身體上有小泡的線蟲。（21）本實驗的連續(xù)性強、時間跨度大，因此要注意每步實驗操作，避免出現(xiàn)錯誤（如沒有無菌操作、沒有及時挑取突變體等），否則就會對實驗結果產(chǎn)生影響。（22）長菌的培養(yǎng)基并不影響線蟲生長，只是影響線蟲觀察影響，盡管少數(shù)時候會誘導長泡型的突變體產(chǎn)生，但是千萬不能因此去用pick挑走菌落，這樣不但會使培養(yǎng)基里長出更多因挑菌而產(chǎn)生的分散的菌落，還極有可能將隱藏在菌里面的線蟲突變體或卵挑走。我們實驗最后突變體的培養(yǎng)皿中只能觀察到很少的突變體可能就是這