1、提取細胞RNA的步驟提取細胞RNA的步驟：1)六孔板每孔細胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，槍頭吹打。2)將各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振搖15s。1530下孵育2-3min，離心（4，12，000g，15min）。3)離心后液體分為三層（上層無色水樣層為RNA，中層白色為DNA和底層紅色為蛋白質(zhì)），小心吸取上層無色液體移入一新的EP管中。4)加入等體積異丙醇，0.40.5ml，混勻，15-30下孵育1030min，離心（4，12，000g，10min）。其中如果加入等體積異丙醇后，置于試管架上用PE手套密封后，放于4冰箱中，沉淀30min效

2、果更好。5)去上清，沉淀加入75乙醇1ml，漩渦振蕩30s，離心（4，7，500g，5min）。6)小心去上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺中鼓風靜置干燥3-5min。最好是用槍頭吸取上清，盡量除去。7)加入20ul DEPC水溶解，分裝5ul/管，-70冰箱保存。8)細胞總RNA的鑒定：0.9-1.2瓊脂糖電泳鑒定細胞總RNA，觀察出現(xiàn)條帶及各條帶亮度。紫外分光光度計測定：分別測定細胞總RNA在260nm和280nm處的光密度值(OD),并計算RNA的含量和純度。1、實驗目的提取人體細胞的總RNA和mRNA。2、本實驗所需試劑1）、CNE-2細胞及培養(yǎng)細胞的一系列條件，2）、PBS緩沖液， TRIZOL

3、試劑，3）、DEPC處理過的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,4）、新的氯仿、異丙醇和乙醇，5）、mRNA分離試劑盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。6）、新配的電泳緩沖液，專跑RNA的瓊脂糖（Agarose）。3、實驗流程3.1 細胞總RNA的提取1）、6孔板細胞（CNE-2）匯合度為90-100%時，取出無菌室，去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑（Gibco公司） 1 ml，搖勻，無菌罩內(nèi)消化3-5分鐘（觀察：液體變粘稠，細胞脫壁）。2）、將各孔內(nèi)消化好的細胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5 ml EP管

4、中，加新開的氯仿0.2 ml，輕搖15秒。3）、室溫靜置2-3分鐘后，12000 rpm，15 min，4，離心。然后取上清無色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過），加0.5 ml新開的異丙醇，室溫下靜置10分鐘。4）、12000 rpm，10分鐘，4，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清（小心別丟了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4離心。5）、去上清，點離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10分鐘， DEPC處理水20-30 ul加入，中槍打勻，55-60水浴10分鐘溶解總RNA，測OD值。6）、電泳。3.2 從

5、總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）1）、取上述提取的總RNA若干（少于0.25 mg）到一個新的無RNase 的EP管中，用無RNase的水定容到250 ul。2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打勻或用手彈勻。3）、70水浴，3分鐘（裂解RNA的二級結構）。4）、20-30條件下，靜置10分鐘（讓Oligotex與mRNA結合）。5）、高速離心2分鐘，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50 ul的上清在原管里。6）、用Buffer OW2

6、400 ul重懸含Oligotex/mRNA復合物的沉淀，然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1分鐘。7）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速離心1分鐘，丟掉濾過液。8）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100 ul熱的（70）Buffer OEB到柱子上，用Tip來回吸打3-4次，高速離心1分鐘。9）、為保證最大的 mRNA產(chǎn)量，可再次重復第8步。10）、電泳。4、mRNA的應用：RT-PCR, Northern雜交，cDNA文庫構建, mRNA末端快速擴增(RACE)，差異表達(DDRT-PCR)，引物延伸反應(Primer Extension)，體外轉錄(In Vitro RNA Transcription)