1、純化水、注射用水微生物檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證方案（VP） 文件編號(hào)：VP-JY-0026-01 項(xiàng)目名稱：純化水、注射用水微生物檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證 材料分享#項(xiàng)目部門職務(wù)簽名日期起草人質(zhì)量管理部化驗(yàn)員年 月 日審核人質(zhì)量管理部中心化驗(yàn)室主任年 月 日審核人質(zhì)量管理部質(zhì)量管理部經(jīng)理年 月 日批準(zhǔn)人驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組質(zhì)量副總經(jīng)理年 月 日目錄1 引言41.1 驗(yàn)證實(shí)施進(jìn)度計(jì)劃41.2 概述42 驗(yàn)證所需設(shè)備清單43 驗(yàn)證人員、職責(zé)43.1 項(xiàng)目驗(yàn)證小組成員43.2 驗(yàn)證變更43.3 驗(yàn)證培訓(xùn)44 驗(yàn)證目的55 驗(yàn)證內(nèi)容55.1 培養(yǎng)基配制55.2 菌種55.3 菌液的制備55.4 薄膜過濾法檢測微生物65.5 結(jié)果

2、評價(jià)76 驗(yàn)證過程中的偏差及處理7 7 驗(yàn)證結(jié)果的評定與結(jié)論78 附件81 引言1.1 驗(yàn)證實(shí)施進(jìn)度計(jì)劃實(shí)施時(shí)間計(jì)劃安排在 年 月 日至 年 月 日。1.2 概述通過驗(yàn)證以確認(rèn)R2A適用于薄膜過濾法檢驗(yàn)純化水、注射用水微生物。根據(jù)培養(yǎng)基及驗(yàn)證菌的特性制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，則R2A可用于薄膜過濾法檢驗(yàn)純化水、注射用水微生物。2 驗(yàn)證所需設(shè)備清單2.1. XG1.D脈動(dòng)真空滅菌器2.2. MJ-250-I型霉菌培養(yǎng)箱 (2025)2.3. LPH-250生化培養(yǎng)箱 (3035)2.4. WG11-230BE電熱鼓風(fēng)干燥箱2.5. 微

3、波爐3 驗(yàn)證人員、變更及培訓(xùn)3.1 項(xiàng)目驗(yàn)證小組成員項(xiàng)目驗(yàn)證小組由中心化驗(yàn)室微生物檢驗(yàn)員、質(zhì)檢員、化驗(yàn)室主任、質(zhì)量管理部經(jīng)理等組成，由化驗(yàn)室主任任項(xiàng)目驗(yàn)證組組長，驗(yàn)證小組成員見附表1，具體分工、職責(zé)如下：人員職務(wù)職責(zé)QC室主任負(fù)責(zé)組織驗(yàn)證小組成員起草驗(yàn)證方案，組織驗(yàn)證工作的實(shí)施，并根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果起草驗(yàn)證報(bào)告QA人員負(fù)責(zé)驗(yàn)證實(shí)施過程監(jiān)督。微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)驗(yàn)證的實(shí)施，對樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。3.2 驗(yàn)證變更驗(yàn)證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需變更時(shí)，應(yīng)填寫驗(yàn)證方案變更申請及批準(zhǔn)書(附件2)，報(bào)驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組批準(zhǔn)后執(zhí)行。3.3 驗(yàn)證培訓(xùn) 驗(yàn)證過程中，確認(rèn)方案以及驗(yàn)證中應(yīng)該掌握的技能應(yīng)該進(jìn)行培

4、訓(xùn)，培訓(xùn)應(yīng)遵循員工培訓(xùn)管理規(guī)程。培訓(xùn)情況記錄于附件3。4 驗(yàn)證目的與適用范圍4.1 驗(yàn)證目的根據(jù)中國藥典2015版四部1105項(xiàng)下微生物檢查法的規(guī)定，驗(yàn)證純化水、注射用水微生物檢查方法的適用性，即確認(rèn)檢品、所設(shè)定的檢驗(yàn)條件及檢驗(yàn)程序?qū)┰嚻分锌赡艽嬖诘母黝愇⑸餆o抑制作用,其方法可行有效。4.2 適用范圍 適用于純化水、注射用水微生物檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證。5 驗(yàn)證內(nèi)容 培養(yǎng)基在使用前應(yīng)進(jìn)行適用性的檢查，合格后方可進(jìn)行，通過R2A瓊脂培養(yǎng)基上的菌落與營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基和TSA對照培養(yǎng)基上的菌落比較，以確認(rèn)所采用方法的可行性。5.1 培養(yǎng)基的制備 取適用性檢查合格的R2A瓊脂培養(yǎng)基按照 15.2g加入1

5、000ml純化水的比例進(jìn)行配制， 加熱使其完全溶解，分裝于的錐形瓶中,裝量不得超過容器的三分之二，蓋塞，用無菌布包扎好后進(jìn)行濕熱滅菌121 、15min，滅菌后PH值7.20.2。冷卻后放入28冰箱備用。5.2 菌種 銅綠假單胞菌CMCC（B） 10104 金黃色葡萄球菌CMCC（B） 26 003 枯草芽孢桿菌CMCC（B） 63 501 白色念珠菌CMCC（F）98001 黑曲霉CMCC（F）98003 使用以上各種菌株傳代次數(shù)均不得超過5代5.3 菌液的制備：接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上， 3035培養(yǎng)1824 小時(shí)；接種白色念珠菌的

6、新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)23天，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)10100CFU（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng) 物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)57 天，加入35ml 含0.05（v/v）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05（v/v）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù)10100CFU 的孢子懸液。 菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28可在24 小時(shí)內(nèi)使用。5.4 菌液的計(jì)數(shù)：（每種菌液每種培養(yǎng)基接種2個(gè)平皿）

7、5.2.2.1 分別接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌至培養(yǎng)皿，每皿接種1ml菌液（10100cfu），傾注TSA對照培養(yǎng)基，凝固后于3035倒置培養(yǎng)不超過5天。營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基方法同TSA對照培養(yǎng)基。 5.2.2.2 分別接種白色念珠菌2皿，每皿接種1ml菌液（10100cfu），傾注胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基，凝固后于3035倒置培養(yǎng)不超過5天。5.2.2.3 用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將黑曲霉制成每1ml含孢子數(shù)10100cfu的孢子懸液。取1ml菌液至胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基3035培養(yǎng)不超過5天。5.4 薄膜過濾法檢

8、測微生物5.4.1 制備平皿 取在28冰箱中保存的培養(yǎng)基，微波爐溶化后按標(biāo)準(zhǔn)操作程序傳至微生物限度檢查室，待培養(yǎng)基冷卻至50左右澆注平皿（每皿302ml，注意培養(yǎng)皿不得破裂，裝量應(yīng)相同，盡量避免形成氣泡）。5.4.2 水樣的檢測 取純化水5ml加入滅菌純化水50ml薄膜過濾，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行水樣微生物的檢測后，取膜置于R2A瓊脂培養(yǎng)基，在3035恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)5天。取注射用水100ml薄膜過濾，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行水樣微生物的檢測后，取膜置于R2A瓊脂培養(yǎng)基，在3035恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)5天。 5.4.3 對照樣品 另取含菌數(shù)10100CFU的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌

9、、白色念珠菌、黑曲霉1ml加入濾杯內(nèi)， 分別取純化水、注射用水同上操作過膜后，取膜置于R2A瓊脂培養(yǎng)基，在3035恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)5天。TSA對照培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基上方法同R2A瓊脂培養(yǎng)基。 5.4.4 陰性對照 另取滅菌純化水50ml薄膜過濾后置于R2A瓊脂培養(yǎng)基、TSA對照培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基上，作為陰性對照。在3035恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)5天。5.4.5 空白對照 另取滅菌的濾膜置于R2A瓊脂培養(yǎng)基、TSA對照培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基上，作為空白對照。在3035恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)5天。5.5 結(jié)果評價(jià) 逐日觀察培養(yǎng)皿微生物生長情況，被檢培養(yǎng)皿與營養(yǎng)瓊脂和TSA對照培養(yǎng)皿比

10、較菌落形態(tài)大小應(yīng)一致，菌落平均數(shù)的比值在0.5-2（50-200）范圍內(nèi)，則可確定R2A瓊脂培養(yǎng)基適用于薄膜過濾法進(jìn)行制藥用水微生物檢測。6 驗(yàn)證過程中的偏差及處理在執(zhí)行驗(yàn)證過程中，檢測人員需要及時(shí)記錄出現(xiàn)的任何偏差，并按照偏差處理管理規(guī)程進(jìn)行處理。7 驗(yàn)證結(jié)果的評定與結(jié)論驗(yàn)證各項(xiàng)驗(yàn)證工作結(jié)束后，驗(yàn)證項(xiàng)目小組負(fù)責(zé)收集、匯總各項(xiàng)驗(yàn)證、試驗(yàn)結(jié)果記錄，依據(jù)各項(xiàng)驗(yàn)證結(jié)果起草驗(yàn)證報(bào)告，對驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行評定與結(jié)論，報(bào)驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組。評定與結(jié)論至少包括以下內(nèi)容：1） 驗(yàn)證項(xiàng)目是否有遺漏?2） 驗(yàn)證實(shí)施過程中對驗(yàn)證方案有無修改？修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)？3） 驗(yàn)證記錄是否完整？4） 驗(yàn)證結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求

11、？5） 如有異常情況、偏差處理是否合理？是否需要進(jìn)一步補(bǔ)充驗(yàn)證？6） 驗(yàn)證項(xiàng)目是否通過驗(yàn)證，可否投入使用？7） 日常監(jiān)測（使用）的建議。8） 再驗(yàn)證周期。 8 附件附件1 驗(yàn)證小組成員名單驗(yàn)證方案名稱驗(yàn)證方案編號(hào)姓名所在部門崗位及驗(yàn)證中負(fù)責(zé)工作附件2驗(yàn)證方案修改申請及批準(zhǔn)書驗(yàn)證方案名稱驗(yàn)證方案編號(hào)修改內(nèi)容修改原因及依據(jù)修改后方案審 批起草人： 日期：項(xiàng)目驗(yàn)證組組長： 日期： 驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組組長： 日期：附件3驗(yàn)證培訓(xùn)記錄（一）培 訓(xùn) 時(shí) 間培 訓(xùn) 對 象培 訓(xùn) 講 師培 訓(xùn) 內(nèi) 容：被 培 訓(xùn) 人 員 簽 名序號(hào)姓名考核結(jié)果考核人合格 不合格合格 不合格合格 不合格合格 不合格合格 不合格合格

12、不合格合格 不合格合格 不合格合格 不合格合格 不合格合格 不合格附件4驗(yàn)證所需文件序號(hào)文件名稱編號(hào)存放地點(diǎn) 結(jié)論：檢查人： 年 月 日 復(fù)核人： 年 月 日附件5純化水菌落回收率記錄 培養(yǎng)基 菌種R2A瓊脂培養(yǎng)基（5ml供試品+50ml滅菌水薄膜過濾）R2A瓊脂培養(yǎng)基（1ml菌液+50ml滅菌水薄膜過濾）營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基（5ml供試品+50ml滅菌水薄膜過濾）營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基（1ml菌液+50ml滅菌水薄膜過濾）TSA對照培養(yǎng)基（5ml供試品+50ml滅菌水薄膜過濾）TSA對照培培養(yǎng)（1ml菌液+50ml滅菌水薄膜過濾）R2A瓊脂培養(yǎng)基（陰性對照）營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基（陰性對照）TSA對照

13、培養(yǎng)基（陰性對照）回收率與TSA對照培養(yǎng)基比較與營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基比較枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌黑曲霉菌與對照培養(yǎng)基比較，菌落大小、形態(tài)是否一致標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定與對照培養(yǎng)基比較，菌數(shù)比值應(yīng)在0.5-2（50-200）范圍內(nèi)。結(jié)果確認(rèn)：檢驗(yàn)人/日期： 復(fù)核人/日期：附件6注射用水菌落回收率記錄 培養(yǎng)基 菌種R2A瓊脂培養(yǎng)基（100ml供試品薄膜過濾）R2A瓊脂培養(yǎng)基（1ml菌+100ml供試品薄膜過濾）營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基（100ml供試品薄膜過濾）營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基（1ml菌液+100ml供試品薄膜過濾）TSA對照培養(yǎng)基（100ml供試品薄膜過濾）TSA對照培培養(yǎng)（1ml菌液 +100ml供試品薄膜過濾）R2A瓊脂培養(yǎng)基（空白對照）營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基（空白對照）TSA對照培養(yǎng)基（空白對照）回收率與TSA對照培養(yǎng)基比較與營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基比較枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌黑曲霉菌與對照培養(yǎng)基比較，菌落大小、形態(tài)是否一致標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定與對照培養(yǎng)基比較，菌數(shù)比值應(yīng)在0.5-2（50-200）范圍內(nèi)。結(jié)果確認(rèn)檢驗(yàn)人/日期： 復(fù)核人/日期：附件7驗(yàn)證過程的偏差及處理驗(yàn)證方案名稱/編號(hào)偏差描述處理方式偏差報(bào)告人報(bào)告人： 日期：評價(jià)驗(yàn)證項(xiàng)目組長：