1、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),匯報(bào)人: 布沙熱木.阿布力孜 瑪伊熱.努熱艾合買提 夏尤普.玉蘇甫 阿布力米提.莫明,酵母雙雜交 谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)(GST-pull down） 免疫共沉淀 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BIFC) 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（）技術(shù),常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),一、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng),Two-hybrid system 是90年代初發(fā)展起來的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（target protein）相互作用的基因。 基本原理： 真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的,如GAL4 （酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的基因）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互

2、不影響。但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無法完成激活功能。,酵母激活因子 GAL4：N端：147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域(BD)， C端：113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。,BD,A,COOH,AD,B,

3、NH2,COOH,共轉(zhuǎn)化,+,BD,A,AD,Gal4,Gal4,Promoter,Reporter,NH2,Gal4,Gal4,B,酵母雙雜交基本過程,舉 例,二、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)(GST-pull down）原理,GST-融合蛋白,GST,X,Y,谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,細(xì)胞裂解物,tube,4下孵育2h,GST,X,Y,+,GST pull down實(shí)驗(yàn)流程,（1） Glutathione 瓊脂糖珠預(yù)處理。 （2） GST融合蛋白掛柱：取適量GST-融合蛋白與10l已經(jīng)處理過的beads置于1.5ml離心管中， 4, 搖床孵育過夜。 （3） 孵育過夜的蛋白質(zhì)與beads的混合液

4、于4,500g離心5min，上清收集，觀察融合蛋白是否飽和地掛在beads上，用1ml冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液洗三次beads。 （4） 將菌體用溶菌酶處理，之后破碎細(xì)菌壁，最大轉(zhuǎn)速4離心20min,收集上清液。 （5） 將細(xì)胞裂解液上清加入beads中，混勻，4，搖床3h。 （6） 3h后，用冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液洗三次。 （7） 加15l 2SDS上樣緩沖液，煮沸5min. （8） SDS-PAGE,Western Blot或質(zhì)譜儀分析。,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)

5、生理性相互作用的有效方法。 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當(dāng)用預(yù)先固化在argarose beads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對(duì)B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。,三、免疫共沉淀原理,三、免疫共沉淀原理,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)流程,（1）將菌體用溶菌酶處理，冰上裂解30min,之后破碎細(xì)菌壁，最大轉(zhuǎn)速4離心30min,收集上清液。冰上裂解30min, （2） 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1g相應(yīng)的抗體加入到細(xì)菌裂解液，4C緩慢搖晃

6、孵育過夜。 （3） 取10l protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min。 （4） 將預(yù)處理過的10l protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。 （5） 免疫沉淀反應(yīng)后，在4C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底。將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗34次。最后加入15l的2SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。 （6） SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析.,四、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)( bimole

7、cularfluorescence complementation , BIFC),BiFC技術(shù)是將熒光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接。如果兩個(gè)目標(biāo)蛋白因?yàn)橛邢嗷プ饔枚咏褪沟脽晒獾鞍椎膬蓚€(gè)分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作用，對(duì)研究蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。,BIFC的優(yōu)勢(shì),在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用的蛋白發(fā)生的時(shí)間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號(hào)分子對(duì)其相互作用的影響等。,五、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（）技術(shù),技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種新的檢測(cè)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。是建立在非輻射能量轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)上，在一個(gè)發(fā)光或熒光供體發(fā)光酶（lux）和一個(gè)熒光受體（如綠色熒光蛋白G）之間會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。供體發(fā)光酶在相應(yīng)底物存在時(shí)發(fā)射光波。能量受體是熒光蛋白，在一定波長范圍內(nèi)吸收光波，并在一定的波長范圍內(nèi)發(fā)射光波。 將兩個(gè)目的蛋白分別和供體和受體形成融合蛋白，兩個(gè)目的蛋白之間距離足夠近并發(fā)生相互作用，即可檢測(cè)到信號(hào)。,蛋白質(zhì)