1、石蠟組織切片技術簡介,動物科技學院 賈 斌,石蠟切片制作過程,切片前的設備試劑準備,取材,固定,修塊,沖洗,修切,脫水,透明,包埋,修蠟,切片,粘片,烤片,脫蠟,入水,染色,脫水,透明,封片,烘干后粘貼標簽。,石蠟切片制作過程,一、切片前的設備、試劑準備,1、設備：,顯微鏡 切片機 磨刀機 脫水機 恒溫箱,離心機 天平 酸度計 定時器 手術器械,染色架 蓋玻片 載玻片 浸蠟和包埋用具,水浴鍋 染色缸 冰箱 石蠟,石蠟切片制作過程,一、切片前的設備、試劑準備,1、試劑：,蛋白甘油 鹽酸-酒精 石炭酸-二甲苯 碳酸鋰飽和水溶液,碘酒 Lugol碘液 苯胺水 Ringer液 Locke液,升汞飽和水

2、溶液 酒精稀釋液 酸缸洗液 各種固定液（17種）,石蠟切片制作過程,一、取材,1、動物的致死：,A:麻醉法（乙醚麻醉不利于丘腦下部神經(jīng)分泌物染色） B:空氣栓塞法（不適宜于血管注射標本） C:擊頭法（不適宜于腦部標本制作） D:斷頭法 E:股動脈放血法（不適宜于腸系膜鋪片的制作）,取材要快！,石蠟切片制作過程,一、取材,2、取材注意事項：,A:材料新鮮。 B:組織塊力求小而薄（0.5120.525厘米） C:勿使組織塊受擠壓、重復切割。 D:保持組織原有形態(tài)（變形，皮膚的固定） E:熟悉要取材的部位。 F:注意品種的選擇。（肥大細胞-小鼠；胰島-豚鼠） G:選擇好組織的切面。,石蠟切片制作過程

3、,二、固定,一、固定方法：,1:蒸汽固定法。（適宜于小而薄的組織） 2:注射、灌注固定法。（局部、全身，在全身浸泡） 3:小塊組織固定法。 （最常用的方法）,二、固定目的：,1: 防止自溶 2: 防止膨脹和收縮 3:使組織塊硬化便于制片 4:保持原有狀態(tài) 5:防止組織塊在制片過程中損壞。 6:使不同組織產(chǎn)生不同的折光率，對染料不同的親和力。,石蠟切片制作過程,二、固定,一、注意事項：,1:組織塊不宜過大。 2:固定液量大于組織塊體積20倍。（底部襯脫脂棉） 3:選擇滲透力強、組織不易收縮或膨脹的固定液。 4：固定時間要根據(jù)組織塊的大小、氣溫、固定液的不同而定。 5：一般要在固定后23小時再修整

4、、再固定。 6：取材之前要考慮好一些特殊的組織所需的特殊固定液。,石蠟切片制作過程,二、固定,不同固定液滲透速度（肝臟、室溫，引自Culling,1974）,石蠟切片制作過程,二、固定,一、固定液,1、單純固定液： 1.1：酒精： 是一種還原劑，不能與鉻酸、重鉻酸鉀、鋨酸混合。多用于復合固定液使用。8095%的固定效果好。滲透力弱。經(jīng)其固定的細胞核著色不良，不宜與染色體的固定。高爾基體、線粒體的固定避免使用酒精。其縮水性強（20%），組織變硬。多用于糖原的固定。,固定液分為單純固定液和復合固定液。一個好的固定也應該具有滲透力強，組織不變形，染料具有較好的親和性，組織有一定的硬度和折光率。,石蠟

5、切片制作過程,二、固定,1、單純固定液： 1.2：甲醛水溶液： 是一種還原劑。常用10%的甲醛（市售），亦即4%的甲醛（福爾馬林）。 甲醛滲透力強，固定均勻，收縮小，多用于大塊組織。對核的染色較好。要沖洗2448小時。pH中性較好，易變酸性（可用碳酸鈣、碳酸鎂中和）。 三聚甲醛不能使用。福爾馬林色素沉淀可以用堿酒精浸泡除去。,石蠟切片制作過程,二、固定,1、單純固定液： 1.3：升汞（氯化汞）： 是一種劇毒白色粉末。常用飽和水溶液，可以固定蛋白質(zhì)，但不能固定類脂、碳水化合物。 升汞的滲透力強，固定均勻，有一定的收縮，大多與醋酸、鉻酸鹽及甲醛等混合使用。對核的染色較好，胞質(zhì)染色也較好。 用升汞固

6、定的組織需要脫汞處理，否則影響染色。 脫汞處理可以組織塊脫汞法、切片脫汞法。,石蠟切片制作過程,二、固定,1、單純固定液： 1.4：醋酸（乙酸、冰醋酸）： 可以沉淀細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)，但不能固定或沉淀細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)。既不能保存糖，也不能固定類脂、脂肪。所以，一般多于其他的固定劑混合使用，作為復合固定劑的一種成分，很易和其他的固定劑混合。 醋酸的滲透力強，速度很快，固定均勻，有一定的膨脹作用，同時不使組織塊變硬。常與能使組織塊收縮、變硬的固定劑混合使用。,石蠟切片制作過程,二、固定,1、單純固定液： 1.5：苦味酸（三硝基苯酚）： 姜黃色結晶，干燥時極易燃燒，劇烈震動可能爆炸。一般以飽和水溶液保

7、存?？梢院驮S多固定劑混合。除固定外還可用作染色劑。 可以固定蛋白質(zhì)，但不能固定脂肪、類脂。 苦味酸的滲透力很弱，一般不單獨使用，固定后可以使組織明顯收縮，同時可以使組織塊軟化。常用于皮膚和肌腱的固定。 苦味酸固定組織塊不宜超過24小時，否則對蘇木精染色不利。有時需要用酒精脫去其黃色。,石蠟切片制作過程,二、固定,1、單純固定液： 1.6：重鉻酸鉀（紅礬鉀）： 橙紅色結晶，不溶于醇，為強氧化劑。一般不能與酒精、甲醛混合，否則幾小時即失效。 重鉻酸鉀的滲透力快，對組織稍有膨脹作用，固定后對酸性染料著色好，對堿性較差，可以和升汞一起用來彌補。 重鉻酸鉀對組織的固定常隨pH值的變化而變化，不同的pH值

8、下可以固定不同的成分和細胞器。 重鉻酸鉀常備水溶液為3-5%，是Zenker液、Helly液、Regaud液的主要成分。 經(jīng)重鉻酸鉀、鉻酸、鉻酸鹽固定的組織均要充分流水沖洗。,石蠟切片制作過程,二、固定,1、單純固定液： 1.8：鉻酸（三氧化鉻）： 為強氧化劑。對核染色較好。 鉻酸的穿透速度慢，硬化中等，收縮明顯。組織塊固定后要避光保存，充分沖洗。 1.9：丙酮 穿透力強，能使組織強烈收縮，對核染色差，與酒精的作用基本相同。 1.9：三氯醋酸 與醋酸的作用相似，也可以膨脹組織塊，很少單獨使用，還是一種優(yōu)良的脫鈣劑。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.1：酒精-甲醛液（AF液）：

9、 95%酒精或無水酒精（A） 90ml 40%甲醛水溶液 （F） 10ml 此液有固定和脫水作用，固定后可直接進入到95%酒精中繼續(xù)脫水。適用于皮下組織中肥大細胞的固定。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.2：Carnoy液： 冰醋酸 1 份 氯仿 3 份 無水酒精 6 份 浸透速度快，固定時間不宜過長。冰醋酸可以防止酒精的收縮和硬化，因此酒精與冰醋酸的比例可自調(diào)。 對于固定糖原及尼氏體以及DNA和RNA等比較好。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.3：Bouin液： 飽和苦味酸水溶液 75ml 甲醛水溶液 （40%） 25ml 冰醋酸 5ml 實際比例為15

10、：5： 1 ，比較常用。滲透力強，固定均勻，收縮小，染色效果好。注意脫色。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.4：苦味酸-硫酸液： 蒸餾水 100ml 硫酸 2ml 將苦味酸加至飽和（苦味酸結晶粉直接加入）。 此液非常適合于固定胚胎，特別是固定雞胚，2-4小時即可。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.5：Rossman液： 苦味酸無水酒精飽和液 90份 中性甲醛水溶液（40%） 10份 2.6：Susa液： 升汞 4.5克 三氯醋酸 2克 氯化鈉 0.5克 蒸餾水 80ml 甲醛水溶液（40%） 20ml 冰醋酸 4ml 此液的滲透力非常強，收縮小，對內(nèi)耳等難固

11、定的組織較好。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.7：Romeis液： 飽和升汞水溶液 50ml 5%三氯醋酸水溶液 40ml 甲醛水溶液（40%） 10ml 此液甲醛水溶液必須在臨用時加入，固定12-24小時，固定后可轉(zhuǎn)入90%的酒精中。此液可作為一般的固定液，對Heiden-hain鐵蘇木精染色特好，可能有后媒染的作用。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.8：甲醛-醋酸鈉（鈣）-升汞液： 醋酸鈉（鈣） 2克 升汞 6克 甲醛水溶液（40%） 10ml 蒸餾水 90ml 此液臨配臨用，適合于固定胰腺，對區(qū)分胰島細胞較好。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固

12、定液： 2.9：Stieve液： 飽和升汞水溶液 76ml 冰醋酸 4ml 甲醛水溶液（40%） 10ml 此液滲透力很強，與Susa液相似，固定較大的組織塊較好，固定后轉(zhuǎn)入70%酒精中，最好是固定后脫汞。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.10：Orth液： 重鉻酸鉀 2.5克 蒸餾水 100ml 甲醛水溶液（40%） 10ml 此液滲透力較弱，固定時間一般36-72小時，臨用前加入甲醛水溶液，固定后流水沖洗24小時。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.11：Zenker液： 重鉻酸鉀 25克 升汞 5克 硫酸鈉 1克 蒸餾水 100ml 冰醋酸 5ml 前4

13、種試劑加熱溶解后過濾，貯存于棕色瓶中，臨用前加入冰醋酸，此后很快后失效。 此液是最為常用的一種固定液，效果均較好，固定后流水沖洗24小時。,石蠟切片制作過程,二、固定,2、混合固定液： 2.12：Helly液： 重鉻酸鉀 2.5克 升汞 5克 硫酸鈉 1克 蒸餾水 100ml 甲醛水溶液（40%）冰醋酸 5ml 此液固定細胞質(zhì)較好，適合于固定細胞質(zhì)中的顆粒，配成中性或弱堿性較好，適合于胰島、腦垂體細胞的固定。固定的原理與Zenker也不同，不形成鉻酸。若在Zenker液的貯存液中加入10毫升甲醛水溶液叫Maximow液。,石蠟切片制作過程,三、固定后處理,后處理主要包括：修整、沖洗、脫水、透明

14、。 1、洗滌和修整： 固定后的組織用水或酒精稍加清洗然后修切，將受到擠壓、刀傷和不需要的部分切除，同時選擇好包埋面。 2、沖洗： 一般均適用流水沖洗，但是，用酒精或是苦味酸的固定液用酒精洗滌。沖洗的方法注意入水口在下，出水口在上。水不能太大。,石蠟切片制作過程,三、固定后處理,沖洗的方法 A：不正確 B：正確,石蠟切片制作過程,三、固定后處理,后處理主要包括：修整、沖洗、脫水、透明。 3、脫水： 一般的固定液均含有水，石蠟等無法進入，必須用既能和水任意比例混合也能溶解石蠟的溶劑（脫水劑）來置換水，然后再用石蠟來置換次溶劑。 脫水劑很多，最常用的是酒精。還有丙酮，正丁醇，叔丁醇，二氧陸環(huán)等。 酒

15、精的特點是脫水能力強，易使組織變硬、變脆、收縮，所以要從低濃度開始，脫水時間不宜過長，但70%酒精可以長期保存。一般3-5mm組織塊脫水1.5-2.5小時。無水酒精時間要短，否則變脆，但是要充分脫水，否則不能包埋。 丙酮的脫水能力更強，對組織塊的收縮作用也強。,石蠟切片制作過程,三、固定后處理,4、透明： 透明是脫水與浸蠟包埋之間的過渡階段。 常用的透明劑主要有：二甲苯、甲苯、苯、香柏油、氯仿等。 易溶于酒精，不溶于水，可溶解石蠟。但易使組織變脆和收縮，不宜久存于其中。小塊組織30分鐘即可，大塊組織不能超過2小時。如發(fā)現(xiàn)組織沒有透明，中間部位有渾濁，必須再放進脫水劑中脫水，否則，無法浸蠟。二甲

16、苯總不能有水，若滴入幾滴液體石蠟出現(xiàn)云霧狀，這說明有水，用無水硫酸銅脫水后才可用。 透明步驟： 1）無水酒精：二甲苯=2：1 2）無水酒精：二甲苯=1：1 3）無水酒精：二甲苯=1：2,石蠟切片制作過程,四、包埋,4、包埋： 包埋可以分為水溶性和非水溶性包埋，前者是用碳蠟、明膠等，后者是用石蠟、火棉膠等。還有冰凍切片。 石蠟包埋法是組織切片中最為常用的方法。石蠟主要分為軟蠟和硬蠟兩種，50度以上的叫硬蠟，50度以下的叫軟蠟。一般夏天用硬蠟，冬天用軟蠟。一般切片用52-56度的蠟，4微米以下用56-60度蠟，較厚的切片用52-54度蠟。 第一次用的石蠟一定要熔化一段時間后再用，使其中的氣體、揮發(fā)

17、性物質(zhì)蒸發(fā)，以免出現(xiàn)“蠟花”，同時用一段時間后要過濾一次。石蠟反復熔化會使熔點升高，有時可達到65度。 包埋步驟： 1）二甲苯：石蠟=1：1 30分鐘 2）第一杯熔蠟 1小時 3）第二杯熔蠟 1小時 不能過長 4）第三杯熔蠟 30分鐘 用此蠟包埋,石蠟切片制作過程,四、包埋,4、包埋中要注意的問題： 1）包埋后出現(xiàn)組織塊中心部位石蠟不能進入，可能是由于組織塊脫水不完全。 2）蠟塊中出現(xiàn)“蠟花”，可能是蠟中有雜質(zhì)，或透明劑未能被熔蠟完全置換。 3）包埋過程中，可見包埋容器放入水中冷卻，但速度要慢。 4）在包埋大量組織塊時，要記錄好每塊組織的包埋位置，及時修切蠟塊，表明標簽，以免搞錯。 5）不要在

18、福爾馬林、75%酒精中長時間保存組織塊，固定劑易變性，pH值變化，而蠟塊中可以保存10-20年。,石蠟切片制作過程,五、修塊,1）包埋后的組織塊要及時修切，去除組織塊周圍多余的蠟。 2）修切后蠟塊的大小不一定，一般2X2.5厘米為宜。 3）蠟塊四邊要平行，至少應該上下平行。 4）修切好的蠟塊要粘到蠟臺上，以便切片。,石蠟切片制作過程,六、切片,影響切片的因素很多，如脫水、透明、浸蠟等等幾乎所有的步驟均可影響。另外就是切片機和切片刀的質(zhì)量。刀很多，不同的包埋有不同的刀，在此從略。刀非常鋒利，切片中停切片機后首先鎖定切片機在操作其他動作。 刀的簡介和磨刀（刀與組織塊的夾角應為10度）,石蠟切片制作

19、過程,七、粘片及烘片,可用干貼法和水撈法，常用水撈法。水加熱到40-45度左右，切片放入水中浮于表面，由于表面張力及石蠟將熔使切片展平。然后將洗凈、烘干，表面涂有甘油-蛋清的載玻片伸入水中， 靠近切片慢慢提起即可。 然后烘片。,石蠟切片制作過程,八、脫蠟和入水,此時的切片是充滿石蠟的，而染色液是水溶液，所以必須使切片進入到水中才能染色。 首先是脫蠟，即經(jīng)過3步二甲苯，入水是經(jīng)過無水酒精、各級酒精到水。,石蠟切片制作過程,九、染色,染色方法很多，染料也多種多樣，在此只介紹蘇木精-伊紅（HE）染色法。 1、蘇木精又叫蘇木紫、蘇木素?？扇苡跓崴?、酒精、甘油。不能單獨使用，要加入復鹽和氧化劑。蘇木精氧

20、化后才變成蘇木紅，氧化劑常用碘酸鈉、過錳酸鉀、氧化汞、重鉻酸鉀等等。所以蘇木精染液配置好后放置時間越長越好。蘇木精染液的配法非常多，現(xiàn)只介紹一種。 Hansen鉻礬蘇木精：將10克鉻礬溶于250毫升蒸餾水中，煮沸至溶液呈綠色，再將溶有1克蘇木精的15毫升熱蒸餾水倒入其中，充分混勻，再加入5毫升10%硫酸。然后，將552毫克重鉻酸鉀溶于20毫升蒸餾水中，混勻后倒入上液中，煮沸1-2分鐘，冷卻后過濾，近一段時間氧化后可使用。使用很好，染色30秒至5分鐘，不過染不退色，可以長期保存，氧化時間越長越好。,石蠟切片制作過程,十、染色,2、 伊紅：有伊紅B和伊紅Y之分，一般配成0.5-1%的水溶液或酒精溶液，在染細胞核之后，經(jīng)伊紅復染，達到使細胞質(zhì)染成紅色的目的，最后用95%的酒精分色。,石蠟切片制