1、第二十二章基因工程藥物與疫苗,Genetic Engineering Drugs and Vaccines,Topics,基因工程藥物和疫苗的概念 基因工程藥物和疫苗的種類和制備體系 基因工程蛋白質(zhì)（或多肽）藥物 基因藥物 基因工程疫苗,視頻短片,Genetic Engineering and Health,基因工程產(chǎn)品（藥物和疫苗）,運用現(xiàn)代生物技術(shù) 獲取基因 將基因轉(zhuǎn)入在體外培養(yǎng)的細胞中，或直接在體內(nèi)進行大量表達 獲得的,重組蛋白,DNA（或RNA）,天然的 合成的,生物活性更高 免疫原性降低 毒副作用更低,具有治療作用,什么是現(xiàn)代生物技術(shù)？,現(xiàn)代生物技術(shù),主要包括五項技術(shù)（工程） 基因工

2、程 蛋白質(zhì)工程 細胞工程 酶工程 發(fā)酵工程（微生物工程）,基因工程,概念 在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（通常是DNA）插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體DNA分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之導(dǎo)入到原先沒有這類分子的宿主細胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。也稱DNA重組技術(shù) 。,目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）,基本原理,目的基因的獲取,重組DNA導(dǎo)入宿主細胞,外源基因與載體的連接,克隆載體的選擇和構(gòu)建,重組體的篩選,克隆基因的表達,以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程,第一節(jié) 基因工程藥物和疫苗的種類及制備體系,Section Categories and

3、 Preparation System,蛋白質(zhì)多肽類 藥物和疫苗,核酸類藥物和疫苗,細胞因子 激素 抗菌肽 酶和酶抑制劑 治療性抗體 微生物、寄生蟲和腫瘤疫苗,裸DNA基因藥物 反義核酸藥物 核酸疫苗,一、基因工程藥物與疫苗的種類,二、基因工程藥物和疫苗的制備體系,目的蛋白表達系統(tǒng),關(guān)鍵,運載外源基因的載體,常用載體 質(zhì)粒DNA 噬菌體DNA 病毒DNA,宿主細胞要求,宿主細胞及其載體的遺傳背景清楚，便于進行DNA重組操作； 宿主細胞的代謝途徑及其調(diào)控機制清楚，容易進行代謝調(diào)控； 容易獲得較高密度的細胞培養(yǎng)； 能利用廉價而容易獲得的原料； 產(chǎn)熱少、耗氧低，發(fā)酵溫度適當； 產(chǎn)量和得率高，產(chǎn)物容易

4、提取純化 。,宿主細胞分類,大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 鏈霉菌,酵母 絲狀桿菌 昆蟲細胞 哺乳動物細胞,原核細胞,真核細胞,優(yōu)點：方法簡單，經(jīng)濟 缺點：不能加工表達的真核蛋白質(zhì)，表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體,優(yōu)點：可表達真核基因組DNA，可適當修飾表達的蛋白質(zhì) 缺點：操作技術(shù)難，費時，不經(jīng)濟,三、國內(nèi)外基因工程藥物與疫苗的研發(fā)概況,第二節(jié) 基因工程蛋白質(zhì)（或多肽）藥物,Section Genetic Engineering Protein and Peptide Drugs,一、細胞因子類藥物 二、激素類藥物 三、抗體類藥物 四、溶栓和抗凝血藥物 五、其他活性蛋白類藥物,一、細胞因子類藥物,細胞

5、因子(cytokine),是一類由免疫活性細胞 (淋巴細胞和單核巨噬細胞等 )及其他細胞 （成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等）分泌的具有調(diào)節(jié)細胞功能的高活性多功能小分子蛋白質(zhì)。,重要的細胞因子類藥物,1.干擾素( Interferon, IFN ) 2.白細胞介素( Interleukin, IL ) 3.集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) 4.腫瘤壞死因子( tumor necrosis factor, TNF ) 5.生長因子( growth factor, GF ),1. 干擾素（Interferon，IFN）,性 質(zhì): 多功能的細胞因子 家 族: 20余

6、成員 分 類: IFN-，來源于白細胞、B淋巴細胞和一些腫瘤細胞 IFN-，來源于成纖維細胞 IFN-，來源于T細胞和NK細胞,作用:,促進合成多種抗病毒的蛋白，抑制病毒的復(fù)制和病毒蛋白的合成 具有一定的抗腫瘤作用 免疫調(diào)節(jié)作用,臨床應(yīng)用：,IFN-：粒細胞白血病和慢性病毒性感染 IFN-：多發(fā)性硬化癥 IFN-：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,干擾素的生產(chǎn)：,傳統(tǒng)方法：從人血液中的白細胞內(nèi)提取 每300L血液才能提取1mg 基因工程：將干擾素基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中 每千克培養(yǎng)液可提取20-40 mg,優(yōu)點： 無污染，安全性高 純度高 比活性高 成本低 療效確切,基因工程-干擾素的生產(chǎn),從人白細胞中克隆出-干擾

7、素基因 將此基因與大腸桿菌表達載體連接構(gòu)成重組表達質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得高效表達人-干擾素蛋白的工程菌 工程菌經(jīng)發(fā)酵后可收集到大量菌體 將菌體破裂，用先進的生物工程手段將-干擾素蛋白從菌體中分離、純化 得到高純度的人基因工程-干擾素,基因工程-干擾素,目前我國市場銷售的基因工程干擾素根據(jù)其來源和分子結(jié)構(gòu)的不同，有-1b, -2a, -2b三種亞型，其中-2a, -2b型為進口產(chǎn)品或國內(nèi)仿制產(chǎn)品，而-1b型干擾素系采用中國健康人白細胞來源的干擾素基因克隆和表達的基因工程干擾素。,PEG化的IFN-2a,為了提高代謝半衰期及增強療效，將IFN進行聚乙二醇(PEG)化。 治療慢性乙型肝炎和慢性

8、丙型肝炎,2. 白細胞介素( Interleukin，IL ),性質(zhì)：介導(dǎo)白細胞間相互作用的細胞因子，還參與其他細胞的調(diào)節(jié)，并相互影響，相互制約，由此構(gòu)成了一個開放的，復(fù)雜的細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。 家族：20多成員 作用：刺激T、B細胞增殖 增強NK細胞的殺傷活性 促進血小板的生成和促進B細胞產(chǎn)生抗體,IL-2：某些腫瘤和感染性疾病 IL-11：血小板減少癥,臨床應(yīng)用：,3. 集落刺激因子(colony stimulating factor , CSF),性質(zhì)：參與造血調(diào)節(jié)過程的糖蛋白分子 家族：4個成員 來源：免疫活性細胞所產(chǎn)生 作用：促進造血祖細胞及其分化 宿主抗感染免疫中起作用,包括：,粒細

9、胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF） 多能集落刺激因子（multi-DSF、IL-3） 巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF） 粒細胞集落刺激因子（G-CSF） 促紅細胞生成素（EPO） 血小板生成素（TPO） 干細胞因子（SCF）,臨床應(yīng)用,促紅細胞生成素（EPO）：治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和HIV感染治療的貧血。 粒細胞集落刺激因子（G-CSF）：腫瘤化療引起的嗜中性白細胞減少癥。,4. 腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF ）,性質(zhì)：對腫瘤細胞具有直接殺傷作用的細胞因子 家族（TNFSF）：成員20個 受體家族（TNFRSF） ：成員20個,包括： TN

10、F-及其衍生物 淋巴毒素（TNF- ）及其衍生物 FasL（Fas配體） 腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL） LIGHT 血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子（VEGI）,作用： 細胞增殖、分化 基因激活 細胞毒性和凋亡 宿主防御和炎癥反應(yīng) 自身免疫，器官形成和免疫調(diào)節(jié),應(yīng)用： 治療用蛋白 治療基因 抗體 小分子的靶位 可治療多種疾病，如腫瘤，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，紅斑性狼瘡等。,5.生長因子( growth factor, GF ),體內(nèi)對不同細胞具有促進生長作用的細胞因子,二、激素類藥物,性質(zhì): 由內(nèi)分泌細胞分泌的高效能活性物質(zhì) 分類: 多肽類和類固醇類,目前已批準上市的激素類藥物,三、抗體類藥物

11、,（一）抗體藥物研制的現(xiàn)狀： 治療性單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）技術(shù)是當前國際生物技術(shù)領(lǐng)域開發(fā)的熱點。有著廣闊的發(fā)展前景。,單克隆抗體（或?qū)慰寺】贵w與抗癌藥物結(jié)合），被稱為威力強大的抗體“生物導(dǎo)彈”。 把這種抗體“導(dǎo)彈”注射到癌癥患者的血液中，它就會發(fā)揮導(dǎo)彈樣的作用，在患者體內(nèi)追蹤并附著于癌細胞上，然后導(dǎo)致癌細胞被免疫細胞識別而被殺傷、吞噬或者使與抗體結(jié)合的抗癌藥物殺傷和破壞癌細胞，而且很少損傷正常組織細胞。 優(yōu)點：高度選擇性，對癌細胞命中率高，殺傷力強。,FDA已批準上市的部分單抗藥物,產(chǎn)品 名稱,適應(yīng)癥,目標 抗原,批準 年份,抗體 類型,Oothoclo

12、ne,異體移植,CD3,1986,鼠源抗體,Panorex,腫瘤,17-1A,2019,鼠源抗體,Rituxan,非何杰金淋巴瘤,CD20,2019,嵌合抗體,Remicade,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,TNF-,2019,嵌合抗體,Herceptin,乳腺癌,HER2/neu,2019,人源化抗體,Mylotarg,白血病,CD33,2000,人源化抗體,（二）基因工程抗體,定義：在基因水平上，對抗體分子進行切割、拼接或修飾，或?qū)⑷斯と铣傻目贵w基因?qū)胧荏w細胞表達，產(chǎn)生新型抗體。,舉例： 人-鼠嵌合抗體(chimeric antibody) 改型抗體 (reshaped humanized anti

13、body) 小分子抗體 雙特異性抗體(bispecific antibody),（三）全人單克隆抗體:人-人雜交瘤技術(shù),由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。,單克隆抗體,表位A,表位B,表位C,抗原,克隆A,克隆B,克隆C,單克隆抗體的特點與應(yīng)用,特點：純度高、專一性強、與抗原結(jié)合的特異性強，便于人為處理和質(zhì)量控制。 應(yīng)用：(1)診斷試劑；(2)治療藥物：因為單抗毒性低，抗體本身既可被當作一種治療藥物，也可被用作傳遞藥物的一種載體。,鼠源性抗體 嵌合抗體（人鼠） 人源化抗體（人鼠） （含全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因） 全人抗體（人）,單克隆抗體發(fā)展過程及方向,接受抗原

14、刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。 B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一段時間后便會死亡短命細胞。,單克隆抗體的制備雜交瘤技術(shù) 產(chǎn)生的3個技術(shù)關(guān)鍵,1. B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的特性：,B淋巴細胞(B lymphocytes)：,骨髓瘤細胞 (myeloma cells):,惡性增殖的轉(zhuǎn)化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活長命細胞。 經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細胞株沒有抗體分泌物。,2. 細胞融合技術(shù)：,長命 不分泌抗體,分泌抗體 短命,分泌抗體 長命,Khler和Milstein, 1975,1984年Nobel醫(yī)學(xué)獎,3.

15、雜交瘤細胞的篩選 ：,HAT培養(yǎng)基篩選,H, 次黃嘌呤; A, 氨甲喋呤; T, 胸腺嘧啶,(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 ( HGPRT ),胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase),B淋巴細胞： HGPRT+， TK+,骨髓瘤細胞： HGPRT-， TK-,存活,死亡,內(nèi)源性途徑(主要途徑),A,全人單克隆抗體:人-人雜交瘤技術(shù),原理 將人B細胞與人骨髓瘤細胞株進行融合，經(jīng)培 養(yǎng)和篩選后獲得全人mAb。 優(yōu)點 副作用更小 無需抗體分子結(jié)構(gòu)的再加工 生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)量高（達

16、20070 mg/L） 與人體內(nèi)天然抗體完全一致,四、溶栓和抗凝血藥物,激活血漿纖溶酶原 形成有活性的纖溶酶 催化纖維蛋白發(fā)生水解使血栓溶解,溶栓藥物的作用機理,正在研究的主要溶栓藥物,五、其它活性蛋白類藥物,例如，可溶性受體和粘附分子（CD分子）都是人體自身分子，治療中不易引起免疫應(yīng)答反應(yīng)。,重組可溶性受體,改造受體的胞外區(qū)，使其保留與配基結(jié)合的能力，但又失去信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用?？膳c配基競爭與受體的結(jié)合，發(fā)揮受體阻斷劑的作用。,粘附分子,將粘附分子在體外表達成可溶性分子，發(fā)揮細胞粘附的阻斷作用，治療因粘附分子功能異常導(dǎo)致的疾病 。,抗菌肽類藥物,抗菌肽是許多生物物種基因組編碼的一種內(nèi)源性抵御病原

17、微生物的生物活性短肽。迄今已從昆蟲、兩棲類、哺乳動物等數(shù)科生物物種中分離出幾百種抗菌肽。 抗菌肽由于其特殊的抑菌機制及抗菌譜廣、高效、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，有望成為新一代抗菌藥物及生物防腐劑。 如，研究結(jié)果公布在自然雜志上（Nature，2019，437：975980）上的菌絲霉素具有較強的抗革蘭氏陽性菌作用，其抗肺炎鏈球菌感染的療效與現(xiàn)有抗生素相當。,第三節(jié) 基因藥物,Section Gene Drugs,基因藥物,一是指將具有治療意義的DNA重組載體，直接轉(zhuǎn)移至人體細胞，在體內(nèi)表達出具有治療作用的多肽和蛋白質(zhì)，這實際上就是基因治療。 二是應(yīng)用直接作用于細胞內(nèi)DNA或RNA、抑制基因復(fù)制和表

18、達的核酸片段或其人工合成的類似物，以及對RNA具有特異切割作用的核酶等。,包括：,反基因藥物 反義寡核苷酸 反義RNA 小干擾RNA 肽核酸 核酶,反基因藥物,即反義DNA。 是通過與靶基因結(jié)合形成三螺旋，并且位點專一性地干擾DNA和蛋白的結(jié)合、激活子的轉(zhuǎn)錄起始或轉(zhuǎn)錄延伸等，進而阻止基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。,反義寡核苷酸（ODNs）,通常指進行了某些化學(xué)修飾的短鏈核酸（約15-25個核苷酸組成），它的堿基序列與特定的靶RNA序列互補，進入細胞后可與靶序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)。 反義寡核苷酸與靶基因的RNA結(jié)合后可通過各種不同的機制影響靶基因的表達。,反義RNA,根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計的針對靶RNA(多為mRNA

19、)具有互補序列的RNA分子。 通過與靶RNA互補結(jié)合的方式，從而抑制特定基因的表達。,小干擾RNA（siRNA）,指人工合成的或在細胞內(nèi)表達的短雙鏈RNA（21-23 nt）。 這種雙鏈RNA可誘導(dǎo)序列特異的（同源性的）目標基因的沉寂，抑制細胞內(nèi)特定基因表達。,肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）,是一種與DNA和RNA相似的化學(xué)物質(zhì)，可經(jīng)由人工合成制造，用來作為生物學(xué)研究或是醫(yī)學(xué)治療。 PNA的骨架是由重復(fù)排列的N-2-(氨乙基)-甘氨酸單位，經(jīng)由肽鍵所組合而成，4種堿基為側(cè)鏈，且堿基與骨架之間是以亞甲羰基相連。 由于PNA沒有如DNA或RNA上的磷酸基團，因此PNA與

20、DNA之間缺乏電性相斥的現(xiàn)象，使兩者之間的結(jié)合強度大于DNA與DNA。 PNA與靶DNA結(jié)合后，對轉(zhuǎn)錄可發(fā)揮正負兩方面的調(diào)節(jié)作用，分別實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄的序列專一性的終止或者啟動。,核酶,具有催化活性的RNA。,最簡單的核酶二級結(jié)構(gòu)錘頭狀結(jié)構(gòu),底物部分,通常為60個核苷酸左右 同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份組成錘頭結(jié)構(gòu),人工設(shè)計的核酶,粗線表示合成的核酸分子 細線表示天然的核酸分子 X 表示一致性序列 箭頭表示切斷點,第四節(jié) 基因工程疫苗,Section Gene Engineered vaccines,疫苗,傳統(tǒng)疫苗,滅活疫苗,減毒疫苗,亞單位疫苗,新型疫苗,基因工程疫苗,基

21、因工程疫苗 (gene engineered vaccine),是指通過重組DNA技術(shù)克隆表達保護性抗原基因，利用表達產(chǎn)物或重組體制成的疫苗。 包括基因工程亞單位疫苗、基因工程載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗和蛋白質(zhì)工程疫苗等。,保護性抗原：是指病原微生物的能刺激機體發(fā)生保護性免疫應(yīng)答的抗原成分。,按照使用目的分為： 病毒疫苗 細菌疫苗 寄生蟲疫苗 腫瘤疫苗,基因工程疫苗,1.基因工程亞單位疫苗 (gene engineered subunit vaccine),基因工程表達的蛋白抗原。,免疫原性好 可消除病毒潛在的致癌性 可大量生產(chǎn),特點,一、病毒疫苗,例如,基因工程乙肝疫苗,2. 載體疫苗

22、(vectored vaccine ),將保護性抗原基因重組到減毒或無致病性的微生物(載體)中，當這類微生物感染機體后可表達相應(yīng)的保護性抗原。,特點,多為活疫苗 接種后可在體內(nèi)大量產(chǎn)生目標抗原,常用的載體,痘病毒、腺病毒載體、卡介苗,3. 核酸疫苗( nucleic acid vaccine ),用編碼保護性抗原的基因制成的疫苗,特點,易于制備 便于保存 可多次免疫 可制成多聯(lián)多價疫苗,4. 基因缺失活疫苗 (gene deleted live vaccine),通過基因缺失突變使得病毒的毒力降低或消失且不引起抗原性改變所制備的基因工程病毒活疫苗。,特點,突變性狀明確 穩(wěn)定,5. 蛋白質(zhì)工程疫

23、苗 （protein engineered vaccine),通過基因突變、抗原構(gòu)型改變，或?qū)⒉煌蚧蚪Y(jié)構(gòu)域融合構(gòu)成的疫苗。,特點,免疫原性增強 副作用降低,二、細菌疫苗,傳統(tǒng)疫苗,滅活菌苗 減毒活菌苗 亞單位或成分疫苗,缺點,效價不夠高 需要多次免疫,新的細菌疫苗,通過構(gòu)建突變株、構(gòu)建重組細菌載體、人工合成多肽和制備核酸疫苗等途徑來獲得的細菌疫苗,霍亂菌苗 痢疾菌苗 傷寒桿菌疫苗 幽門螺桿菌疫苗 結(jié)核桿菌疫苗 腸出血性大腸桿菌菌苗,例如,1. B亞單位-全菌體菌苗（BS-WC）：這是由滅活的霍亂弧菌全菌體細胞（WC）和純化的霍亂腸毒素B亞單位（BS）組成的菌苗。其中WC細胞壁含有的抗原，能

24、誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗菌抗體，從而抑制霍亂弧菌在腸道定居；而BS產(chǎn)生的抗毒抗體，使霍亂腸毒素不能發(fā)揮作用。此菌苗保護率為65%85%左右，對古典生物型霍亂弧菌的預(yù)防作用優(yōu)于埃爾托生物型霍亂弧菌。 2. 減毒口服活菌苗CVD103-HgR：這是應(yīng)用DNA重組技術(shù)將除去94%的CtxA基因（霍亂毒素A亞基基因），重組于古典生物型霍亂弧菌的569B株中，獲得減毒株CVD103，然后在染色體上導(dǎo)入一個抗汞（Hg）的編碼基因作為篩選標記，成為CVD103-HgR減毒株。保護率為88%左右。 一般認為保護作用至少持續(xù)6個月。,霍亂菌苗,三、寄生蟲疫苗,例如 瘧疾疫苗,我國研制的PfCP-2，使用酵母為載體高效表達新的疫苗抗原。,四、腫瘤疫苗（cancer vaccines）,利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應(yīng)來抑制腫瘤的生長。,1. 腫瘤細胞及其衍生物疫