1、體內(nèi)藥物分析的樣品處理和方法學(xué)驗(yàn)證,1,1.為什么要對(duì)生物樣品進(jìn)行處理？ 2.有哪些生物樣品？ 3.有哪些樣品處理方法？各自的特點(diǎn)。 4.如何對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證？ 5.有哪些參考標(biāo)準(zhǔn)？,2,生物樣品進(jìn)行前處理的目的在于： 1藥物進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)吸收、分布、代謝，然后排出體外。在體液、組織和排泄物中除了游離型（原型）藥物之外，還有藥物的代謝物、藥物與蛋白質(zhì)形成的結(jié)合物、以及藥物或其代謝物與內(nèi)源性物質(zhì)，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯綴合物等多種形式存在，需要分離后測(cè)定藥物及代謝物。,3,一、處理的目的,2生物樣品的介質(zhì)組成比較復(fù)雜。如在血清中既含有高分子的蛋白質(zhì)和低分子的糖、脂肪、尿素

2、等有機(jī)化合物，也含有Na、K、Cl-等無機(jī)化合物。這些成分會(huì)嚴(yán)重影響測(cè)定的準(zhǔn)確性和靈敏度，同時(shí)會(huì)污染儀器。因此，為了保護(hù)儀器，提高測(cè)定的靈敏度，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理。,4,5,60%以上精力和花費(fèi)用在樣品前處理上,生物樣品包括各種體液和組織，但實(shí)際上最常用的是比較容易得到的血液（全血、血漿、血清）、尿液、糞便、唾液。在一些特定的情況下選用乳汁、腦脊液等。,6,二、生物樣品的種類,全血不易保存，且血細(xì)胞中含有更多的干擾物質(zhì)，影響測(cè)定，故很少采用全血測(cè)定藥物濃度。僅適用于血漿藥物濃度太低或者血漿藥物濃度波動(dòng)大，且難以控制的藥物如：環(huán)孢霉素A。,7,1 全血,測(cè)定血中藥

3、物濃度通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細(xì)胞的全血中的藥物濃度。 將采取的血液置含有抗凝劑（如：肝素、EDTA）的試管中，混合后，3000至4000 r/min離心，分離血細(xì)胞，上清液即為血漿。,8,2 血漿,9,血漿中含有的物質(zhì)種類和比例,血清是在采血后不加任何抗凝劑，于室溫下靜置15-30 min，待其自然凝結(jié)后，離心，分離出上清液。血清顏色較血漿更淺，成分較血漿少了大部分的纖維蛋白，更易進(jìn)行處理，且血漿及血清中的藥物濃度測(cè)定值通常是相同的。,10,3 血清,一般認(rèn)為，當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，血漿中藥物濃度與藥物在作用點(diǎn)的濃度緊密相關(guān)，即血漿中的藥物濃度反映了藥物在體內(nèi)

4、（靶器官）的狀況，因而血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標(biāo)。 血漿和血清可以穩(wěn)定的冰凍保存，一般儲(chǔ)存在-20的條件，長(zhǎng)期保存時(shí)可以保存在-80的條件下，是生物樣品檢測(cè)中最常用的樣本。,11,尿液主要成分是水、尿素及無機(jī)鹽類。尿樣采集后，為了保存，常會(huì)加入防腐劑。 體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型或代謝物及其綴合物等形式排出。 尿液中藥物濃度較高，但尿液濃度受尿量的影響，通常變化較大，應(yīng)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)排入尿中藥物的總量。,12,4 尿液,唾液中所含成分比較簡(jiǎn)單，且容易獲得，但是只有少數(shù)藥物的唾液濃度和血漿游離藥物濃度具有相關(guān)性，實(shí)際使用不多，當(dāng)藥物血漿結(jié)合率高的時(shí)候，唾液中藥物的

5、濃度極低，很難檢測(cè)。,13,5 唾液,采樣后除立即分析外，為防止藥物發(fā)生變化，應(yīng)：短期保存，可 4冷藏；長(zhǎng)期保存，可-20冷凍，不要反復(fù)凍融，必要時(shí)可以加入酶抑制劑和抗氧化劑。,14,生物樣品的保存：,主要應(yīng)考慮生物樣品的種類，被測(cè)藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問題。,15,三、常用的處理方法,1.沉淀蛋白 PPT 2.液液萃取 LLE 3.固相萃取 SPE,16,1.沉淀蛋白,有機(jī)溶劑沉淀法 加入水溶性的有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚。常用的有機(jī)溶劑有：乙睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等。 血漿或血清與有機(jī)溶劑的體積比為1:3時(shí)，就可以將90%以上的蛋

6、白質(zhì)除去，采用低溫高速速離心機(jī)16000r/min離心10min 便可將析出的蛋白質(zhì)完全沉淀。,實(shí)際應(yīng)用中，多是取50uL的血漿，加入500uL的有機(jī)溶劑，渦旋離心后，取上清進(jìn)樣； 若沉淀后，信號(hào)相應(yīng)不好，可嘗試更換有機(jī)溶劑或者在沉淀時(shí)，加入酸或堿，調(diào)節(jié)pH值，可能會(huì)對(duì)結(jié)果影響很大； 常用的酸堿有：鹽酸，甲酸，乙酸，氨水等。,17,優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，為方法開發(fā)中最先考慮使用的。 缺點(diǎn)：只使用于樣品中濃度較高的藥物測(cè)定；且處理后，樣品中仍然會(huì)存在很多干擾物質(zhì)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾；殘余的雜質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱，污染儀器。,18,中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。常用的中性鹽：飽和硫酸

7、胺、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等。鹽析的方法與有機(jī)溶劑提取法常并用，藥物的回收率較高。,加入中性鹽,19,20,20,加入強(qiáng)酸,當(dāng)pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在，加入強(qiáng)酸，可與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽而沉淀。常用的強(qiáng)酸有：10%三氯醋酸等。血清與強(qiáng)酸的比例為1:0.6混合，高速離心,就可除去蛋白質(zhì)。 在酸性下分解的藥物不宜用本法除蛋白。,當(dāng)pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，金屬陽(yáng)離子與蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀。常用的沉淀劑有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含藥物血清與沉淀劑的比例為1:2混合，高速離心、分離后得上清液。,21,加入鋅鹽或銅

8、鹽沉淀劑,在測(cè)定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物時(shí)，常需用酶解法。 在測(cè)定尿中的藥物濃度時(shí)，由于尿中藥物主要以綴合物的形式排除，較原型藥物具有較大的極性，不易被有機(jī)溶劑提取，常用酶水解的方法。,22,酶解法,超速離心法 平衡透析法 最主要的應(yīng)用在測(cè)定血漿中游離的藥物濃度和藥物的血漿蛋白結(jié)合率。,23,其他的一些去除蛋白質(zhì)的方法：,藥物在體內(nèi)吸收，需經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，所以多數(shù)藥物具有一定的脂溶性，而生物樣品中大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)，所以可以根據(jù)藥物分子與基質(zhì)之間極性的差異，使用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑提取藥物，有機(jī)溶劑提取可一次除去大部分雜質(zhì)。,24,2.液液萃取法 LLE,有機(jī)溶劑應(yīng)選擇穩(wěn)定，易揮

9、發(fā)，低毒性，不與水相混溶的溶劑。常用的有機(jī)溶劑有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚和氯仿等。 應(yīng)用本法時(shí)需要考慮所選有機(jī)溶劑的特性、藥物的特點(diǎn)、有機(jī)溶劑相和水相的體積比及水相的pH值等。 酸性藥物的解離：AH + H2O A- + H+ 堿性藥物的解離：B + H2O B+ + OH- 藥物的解離常數(shù)pKa為藥物解離50%時(shí)溶液的pH值。,25,藥物的提取程度主要取決于水相的pH值。對(duì)于堿性藥物，最佳pH值要高于pKa 1-2個(gè)單位；對(duì)于酸性藥物來說，則要低于pKa值1-2個(gè)單位；這樣就可使90%的藥物以非電離的形式存在從而更易溶于有機(jī)溶劑中。 常用來調(diào)節(jié)pH值的物質(zhì)有：甲酸、乙酸、鹽酸 或

10、 氨水、氫氧化鈉等。 水相的PH值-影響液液萃取最關(guān)鍵的因素,26,具體的提取模式有兩種，直接提取和反提取法。 優(yōu)點(diǎn)：樣品經(jīng)過提取后，可除去大部分雜質(zhì)，比較“干凈”；對(duì)有機(jī)溶劑蒸發(fā)后復(fù)溶，可以對(duì)樣品進(jìn)行濃縮；大多數(shù)藥物具有脂溶性，應(yīng)用范圍廣。 缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作繁瑣；且對(duì)血漿進(jìn)行提取時(shí)，血漿中的脂質(zhì)會(huì)一起被提取出，當(dāng)使用質(zhì)譜檢測(cè)器時(shí)，會(huì)在離子源處產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，嚴(yán)重干擾質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性！,27,方法摸索中，一般是使用以上溶劑，平行操作，同時(shí)提取，附加空白對(duì)照，比對(duì)結(jié)果，判斷哪種有機(jī)溶劑的提取效果最好； 若均不理想，可以再混合使用以上溶劑，調(diào)整比例1:1 ,1:2 ,1:3的使用； 在摸索合

11、適的提取溶劑同時(shí)，可根據(jù)藥物的酸堿性嘗試著添加些酸、堿或者離子對(duì)試劑，提高回收率； 提取過程中，一定要嚴(yán)控pH值，對(duì)于兩性藥物則需要使用緩沖溶液保證提取回收率的穩(wěn)定可重現(xiàn)。,28,29,舉例：雌二醇的檢測(cè) 取血漿樣品100uL，+同位素內(nèi)標(biāo)20uL，+甲酸50uL，+正己烷1mL+叔丁基甲醚3mL，渦旋震蕩10min，3000r/min離心10min，-80冷凍10min，倒出上層有機(jī)層，40水浴氮?dú)獯蹈桑?150uL丙酮溶解，+50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40水浴孵育20min，+磷酸鹽緩沖液2mL+叔丁基甲醚4mL，渦旋震蕩10min，3000r/min離心10min，-80冷凍10min，

12、倒出上層有機(jī)層，40水浴氮?dú)獯蹈?，流?dòng)相復(fù)溶。,固相萃取(Solid Phase Extraction，簡(jiǎn)稱SPE)是從八十年代中期開始發(fā)展起來的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)。由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來。主要通過固相填料對(duì)樣品組分的選擇性吸咐及解吸過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度。,30,3.固相萃取 SPE,固相萃取的基本原理和方法： SPE 技術(shù)基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過程；也可以將其近似地看作一種簡(jiǎn)單的色譜過程。 較常用的方法是使液體樣品通過一吸附劑，

13、保留其中被測(cè)物質(zhì)，再選用適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量良溶劑洗脫被測(cè)物質(zhì)，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的。也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測(cè)物質(zhì)流出。,31,32,33,萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！,固相萃取操作一般有五步： 活化甲醇/乙腈 潤(rùn)濕小柱，活化填料； 平衡水或適當(dāng)緩沖液沖洗平衡小柱； 上樣將樣品轉(zhuǎn)移上柱，抽去廢液； 淋洗水或緩沖液最大程度洗去干擾物； 洗脫用小體積的溶劑將被測(cè)物質(zhì)洗脫下來并收集。,34,1.正相色譜原理 2.反相色譜原理 3.離子交換原理,35,根據(jù)原理分類：,36,37,SPE方法的優(yōu)點(diǎn)： 1.不會(huì)發(fā)生乳化；2.適用范圍廣；3.提取效率高； 4.方便快速，

14、可以一次提取分離多種化合物； 5.溶劑消耗少；6.易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化； 7.離子交換固相萃取利用離子交換原理，同色譜柱的依據(jù)極性大小的分離原理不同，配合使用，可以最大限度的分離出藥物，去除干擾。 目前商品化的固相萃取小柱（cartridge）已經(jīng)廣泛應(yīng)用。,38,三種方法的比較：,將藥物進(jìn)行化學(xué)衍生化的目的是：使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)；提高檢測(cè)的靈敏度；增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性；提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體分離的能力等。 藥物分子中含有活潑H者均可被化學(xué)衍生化，如：-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能團(tuán)的藥物都可被衍生化。,39,4.化學(xué)衍生化法,HPLC中化學(xué)衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化

15、兩種方法。 柱前衍生化分析前盡可能將藥物進(jìn)行提取分離后再衍生化，防止其他含有相同的功能基團(tuán)的雜質(zhì)也被衍生化，影響分離。柱后衍生化是藥物經(jīng)色譜柱分離之后進(jìn)行的，所以可形成對(duì)檢測(cè)器具有高靈敏度的衍生物。 HPLC法常用的衍生化試劑有鄰苯二醛、丹磺酰氯、熒胺等。,40,41,定量下限達(dá)10 pg級(jí)別！,待測(cè)藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況 分析測(cè)定的目的與要求 生物樣品的類型與預(yù)處理方法 實(shí)驗(yàn)室條件,42,體內(nèi)藥物分析方法的建立,1. 光譜分析法 2. 色譜法 3. 毛細(xì)管電泳法 4. 免疫分析法 5. 同位素法,43,體內(nèi)藥物分析方法大致可歸為一下幾類：,44,體內(nèi)藥物的HPLC-MS/MS分

16、析方法開發(fā)的一般流程：,1.查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，了解藥物的理化性質(zhì)，選定內(nèi)標(biāo)物質(zhì)； 2.使用標(biāo)準(zhǔn)品，掃描質(zhì)譜條件； 3.選擇色譜柱和流動(dòng)相，摸索合適的液相條件； 4.依據(jù)樣品基質(zhì)，配制模擬生物樣品，選擇相應(yīng)的樣品處理 方法，處理后進(jìn)樣分析； 5.調(diào)整樣品處理方法或液相條件，并可進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)； 6.根據(jù)檢測(cè)目的，設(shè)定定量范圍，對(duì)方法進(jìn)行考察。,方法學(xué)驗(yàn)證（validation）,生物樣品測(cè)定的關(guān)鍵是方法學(xué)的確證。方法學(xué)確證是整個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)。這是藥代動(dòng)力學(xué)研究有別于其它藥理毒理研究的特殊之處。所有藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，都依賴于生物樣品的測(cè)定，只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果，因此必須對(duì)

17、所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。并且在實(shí)際樣品檢測(cè)過程中還應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)控，制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線并對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定，以確保檢測(cè)方法的可靠性。,45,46,47,Guideline on bioanalytical method validation - EMEA,48,49,50,4.校正曲線 Calibration curve,結(jié)果要求： 校正曲線應(yīng)至少包括六個(gè)濃度點(diǎn)以及一個(gè)Matrix Blank 和一個(gè) Control Zero 點(diǎn)（僅作參考，不納入校正曲線的計(jì)算），必要時(shí)可以做雙份測(cè)定；各個(gè)濃度點(diǎn)的準(zhǔn)確度應(yīng)在85% - 115%之間，精密度應(yīng)小于15%，定量下限處為80% - 120%和20%；對(duì)

18、不符合要求的濃度點(diǎn)可以排除計(jì)算，但至少有75%以上的濃度點(diǎn)符合要求；方法驗(yàn)證期間應(yīng)至少提供三條以上的合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線納入統(tǒng)計(jì)。,51,52,質(zhì)控樣品 Quality Control，QC,將標(biāo)準(zhǔn)品加入到生物基質(zhì)中配制成的模擬生物樣品，用作方法學(xué)驗(yàn)證中的考察樣品和樣品測(cè)定中的方法學(xué)質(zhì)控。 低濃度質(zhì)控 (Low QC)濃度不超過LLOQ的3倍； 中間濃度質(zhì)控(Medium QC)濃度一般為定量范圍的中間濃度； 高濃度質(zhì)控(High QC)濃度至少為ULOQ的75%。 質(zhì)控樣品推薦由獨(dú)立人員一次性配制，進(jìn)樣分析合格后分裝，冰凍儲(chǔ)存，每次取足夠數(shù)量的樣品使用，剩余丟棄。,53,54,55,8.穩(wěn)定性 Stability,8.1分析物和內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)貯備液(Stock)和標(biāo)準(zhǔn)工作液(Working)的穩(wěn)定性 8.2樣品冰凍/融三次解穩(wěn)定性，F(xiàn)reeze/Thaw，F(xiàn)/T 8.3樣品融解后短期穩(wěn)定性，Thawed 8.4樣品冰凍的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，Long-term 8.5處理后樣品溶液在進(jìn)樣器中