整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%1蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)題型：名詞解釋 5-6 個(gè)簡(jiǎn)答題 4 個(gè)問(wèn)答和計(jì)算 3 個(gè) 問(wèn)答肯定有一題是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 有一題是蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定附加題目錄第一章 緒論 氨基酸 .1第二章 蛋白質(zhì)制備 .4第三章 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 .10第四章 蛋白質(zhì)的化學(xué)修 .15第五章 肽的人工合成 .17第六章 蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象 .17第七章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 .19每章需掌握的知識(shí)（P.S 結(jié)合了老師最后一節(jié)課的內(nèi)容，但最好不要只按照這個(gè)來(lái)復(fù)習(xí)，有空一定要看 PPT看書(shū)；否則掛了可不要怪我哦?。┑谝徽?緒論 氨基酸常見(jiàn) 20 種氨基酸及其疏水性、親水性、帶電性、代號(hào)、旋光性、等電點(diǎn)疏水性、親水性：不帶電荷 絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺(堿性)帶正電 賴氨酸、精氨酸、組氨酸親水性(極性 R 基)帶電荷(強(qiáng)親水性) (酸性)帶負(fù)電 天冬氨酸、谷氨酸 （懷疑 PPT 的天冬酰胺、谷氨酰胺上打錯(cuò)）疏水性（非極性 R 基） 丙氨酸(R 基的疏水性最?。?、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸甘氨酸：R 基為-H，可算作疏水性氨基酸，又可以劃到親水性氨基酸。甘氨酸的 a-碳不是手性碳，故沒(méi)有旋光性。不帶電荷的極性 R 基氨基酸：帶有 -OH(Ser、Thr 、Tyr ) 、-SH(Cys)、酰胺基(Asn、Gln)整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%2代號(hào)：甘氨酸 Gly 脯氨酸 Pro 蘇氨酸 Thr 天冬氨酸 Asp 丙氨酸 Ala 苯丙氨酸 Phe 半胱氨酸 Cys 谷氨酸 Glu纈氨酸 Val 酪氨酸 Tyr 甲硫氨酸 Met 賴氨酸 Lys 亮氨酸 Leu 色氨酸 Trp 天冬酰胺 Asn 精氨酸 Arg異亮氨酸 Ile 絲氨酸 Ser 谷氨酰胺 Gln 組氨酸 His名詞解釋?zhuān)罕匦璋被幔? 種，體內(nèi)不能合成，必須由食物中的蛋白質(zhì)供給。非必需氨基酸：12 種，只要有氮元素存在人體就能自己制造，組成人體蛋白質(zhì)的重要成份，而且保持一定比例。半必需氨基酸：人體合成速度慢,不能滿足人體需求。氨基酸的等電點(diǎn)：氨基酸分子中所含的NH3 + 和COO 數(shù)目正好相等，凈電荷為 0 時(shí)的環(huán)境 pH 值即為氨基酸的等電點(diǎn) ，簡(jiǎn)稱 pI。氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算： 側(cè)鏈不帶電荷中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的 pK1 和 pK2 的算術(shù)平均值：pI = (pK1+ pK2 )/2 酸性氨基酸：（這個(gè)是對(duì)于含有 3 個(gè)可解離基團(tuán)的氨基酸來(lái)說(shuō)的，可以看下面的方法）pI = (pK1 + pKRCOO- )/2 堿性氨基酸：（這個(gè)是對(duì)于含有 3 個(gè)可解離基團(tuán)的氨基酸來(lái)說(shuō)的，可以看下面的方法）pI = (pK2 + pKRNH2 )/2對(duì)于含有 3 個(gè)可解離基團(tuán)的氨基酸來(lái)說(shuō)，只要依次寫(xiě)出它從酸性經(jīng)過(guò)中性至堿性溶溶解高過(guò)程中的各種離子形式，然后取兩性離子兩側(cè)的 pK 值的算術(shù)平均值，即可得其 pI 值。步驟：由 PK值判斷解離順序，總是 PK1 按照解離順序正確寫(xiě)出解離方程式：簡(jiǎn)式，注意解離基團(tuán)的正確寫(xiě)法。找出呈電中性的物質(zhì)，其左右 PK值的平均值就是氨基酸的等電點(diǎn)：PI（PK 左+PK 右 ）/2整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%3舉例：1.半胱氨酸 pK1(-COO-)=1.96 ， pK2(R-SH)=8.18，pK3(-NH3+)=10.28，該氨基酸 pI值為：A.5.07 B.6.12 C.6.80 D.7.68 E.9.232.賴氨酸 pK1(-COO-)=2.18 ， pK2(-NH3+)=8.95， pK3(R-NH3+)=10.53，該氨基酸 pI值為：A. (pK1+ pK2)/2 B. (pK2+ pK3)/2 C. (pK1+ pK3)/2D. (pK1+ pK2+ pK3)/3 E. (pK1+ pK2+ pK3)/23 .天冬氨酸 pK1(-COO-)=1.96， pK2(-COO-)=3.65 ，pK3(-NH3+)=9.60，該氨基酸pI 值為：A.2.8 B.3.65 C.5.74 D.6.62 E.7.51旋光性：從蛋白質(zhì)溫和水解得到的 a-氨基酸都是 L 型的。D-丙氨酸存在于昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)和蛹中。D-亮氨酸存在于短桿菌肽中。在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了許多 D-型的非蛋白質(zhì)氨基酸D-谷氨酸和 D-丙氨酸存在與細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖中。甘氨酸的 a-碳不是手性碳，故沒(méi)有旋光性。光吸收：220-300nm：Tyr 、Phe、Trp苯丙 Phe 的max 257nm酪 Tyr 的max 275nm色 Trp 的max 280nm蛋白質(zhì)的生物學(xué)/行使的功能：新陳代謝的催化劑-酶。有機(jī)體的結(jié)構(gòu)成分。儲(chǔ)藏氨基酸的功能。運(yùn)輸功能。激素的功能。免疫的功能。接受和傳遞信息作用功能。調(diào)節(jié)或者控制功能。整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%4第二章 蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)分離純化的一般程序及其注意事項(xiàng)1.生物組織的機(jī)械破碎:研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等(細(xì)胞外分泌物無(wú)需破碎)。2.根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。3.離心:去亞細(xì)胞顆粒、細(xì)胞碎片等4.粗提: 離心除去固體雜質(zhì)后，可通過(guò)沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。5.精制：可用層析法、電泳法等進(jìn)行精制。6.結(jié)晶：取得蛋白質(zhì)晶體并測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)。注意事項(xiàng)：動(dòng)物組織和器官要盡可能除去結(jié)締組織和脂肪。制備植物細(xì)胞時(shí)，在緩沖液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以減少褐變, 它可以吸附多酚化合物。革蘭氏陽(yáng)性菌可用溶菌酶消化，37 oC 處理 15 分鐘即可溶解細(xì)胞壁。革蘭氏陰性菌較難消化?？上扔梅请x子去污劑（如 Triton X-100） 、巰基乙醇或甘油處理細(xì)胞。在溶液中還可加入脫氧核糖核酸酶 I（10 ug/mL） ，可以使溶液的黏度降低，可以提高抽提液的質(zhì)量。膜蛋白的釋放：外周蛋白通過(guò)靜電力或共價(jià)鍵和外膜脂質(zhì)的極性頭部螯合在一起。占膜蛋白的 2030%內(nèi)在蛋白（固有蛋白）嵌合在膜脂雙層結(jié)構(gòu)中。大部分膜蛋白是固有蛋白外周蛋白的分離：改變離子強(qiáng)度；金屬螯合劑（EDTA）可將其抽提出來(lái)內(nèi)在蛋白的提?。禾崛〉脑瓌t抽提膜蛋白時(shí)，首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水結(jié)合，同時(shí)保持疏水基暴露在外的天然狀態(tài)。此過(guò)程叫做增溶作用。常用的增溶劑是去污劑，它可以使膜蛋白疏水部分與膜分離，同時(shí)保留住膜蛋白表面的疏水結(jié)構(gòu)。用去污劑增溶之后，膜蛋白要用透析的方法除掉去污劑，再進(jìn)行其他方法的分離純化。整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%5鹽析的概念是一種向蛋白質(zhì)溶液中加入濃的鹽溶液使蛋白質(zhì)變性的方法。鹽溶：一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加 。鹽析：當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出。原因:將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO4 和 NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水” ，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的沉淀。課件重點(diǎn)補(bǔ)充：膜蛋白破碎的主要方法：膜蛋白的釋放，上面有。蛋白質(zhì)脫鹽：透析法（注：用前在含 EDTA 的溶液中煮-除去核酸酶和蛋白酶） ；纖維過(guò)濾透析法； 中空纖維超濾膜分子篩層析法； Sephadex G-25蛋白質(zhì)濃縮：沉淀法：用鹽析法或者有機(jī)溶劑法將蛋白質(zhì)沉淀，再將沉淀溶于少量溶液中；吸附到離子交換柱上，然后用少量鹽洗脫；干燥吸附法：用固體吸附劑如 Sephadex G25 等，凍干法，真空干燥法；滲透濃縮法：將干粉 PEG-20000 涂在裝有蛋白質(zhì)溶液的透析袋上，可吸干水分；超濾濃縮法：用超濾膜濾去小分子和水，達(dá)到超濾的目的。使蛋白質(zhì)沉淀的主要方法及其原理(重點(diǎn):鹽析方法)鹽析法（上面有） ；有機(jī)溶劑法：原理： 1.增大帶電質(zhì)點(diǎn)之間的靜電力。2.破壞蛋白質(zhì)表面的水合層，使蛋白質(zhì)分子脫水而沉淀。有 機(jī)聚合物沉淀法；（作用原理與有機(jī)溶劑類(lèi)似）選擇性變性沉淀法：適用于提取一些耐極端環(huán)境的蛋白質(zhì)。用一些極端條件，使非目標(biāo)蛋白質(zhì)變性析出，從而將目的蛋白質(zhì)純化。主要方法有：熱變性； pH 變性( 包括等電電變性 )；有機(jī)溶劑變性。非特異性層析的原理、方法（如何平衡、如何吸附、如何洗脫.）吸附層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析離子交換層析原理:根據(jù)蛋白質(zhì)分子所帶電荷的不同 來(lái)達(dá)到分離的目的.解離離子帶負(fù)電，結(jié)合陽(yáng)離子（蛋白質(zhì)分子） ，稱為陽(yáng)離子交換柱。解離離子帶正電，結(jié)合陰離子（蛋白質(zhì)分子） ，稱為陰離子交換柱。步驟：（處理介質(zhì)-裝柱-上樣-洗滌- 洗脫-介質(zhì)再生）方法：平衡：電荷量越大,結(jié)合越牢,在柱中移動(dòng)速度越慢;電荷不同,親和力不同.整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%6洗脫：帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合可逆。通常,用鹽梯度和 pH 梯度可把吸附的蛋白質(zhì)從柱上洗脫下來(lái).其他：離子交換的支持物纖維素：具有松散的親水性網(wǎng)絡(luò),較大的的表面積、吸附容量大，通透性好。葡聚糖凝膠：既有離子交換劑的性質(zhì)，又有分子篩效應(yīng)。瓊脂糖凝膠：吸附容量大，能維持較好的流速和分辨率。習(xí)題 1：三個(gè)氨基酸（Leu,Asp,Lys）的混合物，經(jīng)過(guò)一個(gè)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂粒，用 pH5 的緩沖液洗脫，洗脫液中氨基酸出現(xiàn)的順序是AAsp,Leu,Lys; BLeu,Asp,Lys; CLys,Leu,Asp; DLeu,Lys,Asp解：Leu 0,Asp -,Lys + Asp Leu Lys 自己做的，不知道對(duì)不對(duì)習(xí)題 2：有以下 4 種蛋白質(zhì)的混合物：（1）pI=10；（2）pI=4；（3）pI=8.6；（4）pI=5. 若不考慮其它因素，當(dāng)它們流過(guò) DEAE-纖維素陰離子交換柱，用線性鹽梯度洗脫時(shí),這些蛋白質(zhì)的洗脫順序如何，并具體說(shuō)明其原因。答案:在離子交換柱上，帶更多負(fù)電的吸附能力更強(qiáng)。四種蛋白質(zhì) PI 值的順序?yàn)?342。因此，在某種 pH 值下，所帶電荷由正到負(fù)的順序?yàn)?1342。因此，洗脫出現(xiàn)的先后順序就是 1342。凝膠過(guò)濾層析原理：根據(jù)分子量的大小不同而達(dá)到分離的目的。載體是一種多孔的凝膠。分子直徑比凝膠孔徑大的分子,不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中,其他分子由大到小先后從凝膠中流出。疏水層析(吸附層析)原理：根據(jù)蛋白質(zhì)分子疏水性的不同而達(dá)到蛋白質(zhì)分離的目的。在不帶電的載體上偶聯(lián)上疏水基團(tuán)形成疏水吸附劑，將帶有非極性的生物活性物質(zhì)吸附在一起，然后改變層析條件，減弱疏水作用，將吸附物質(zhì)解離下來(lái)。洗脫：改用低濃度的鹽;降低離子強(qiáng)度 ;加乙二醇。在洗脫也中加去污劑；增加洗脫 pH。從高到低的 NaCl 濃度梯度洗脫；或由高到低的鹽濃度加由低到高的乙二醇濃度梯度洗脫。注意： 離子交換：低鹽吸附，高鹽洗脫疏水層析：高鹽吸附，低鹽洗脫親和層析的原理、步驟、作用力、專(zhuān)一性洗脫、非專(zhuān)一性洗脫原理：根據(jù)特定蛋白質(zhì)對(duì)某種的生物專(zhuān)一性來(lái)進(jìn)行分離。作用力：專(zhuān)一性親和力，在一定條件下緊密地形成復(fù)合物。步驟：？洗脫：非專(zhuān)一性洗脫改變緩沖液的離子強(qiáng)度或者 pH 或者介電系數(shù)。使吸附的大分子的 構(gòu)象發(fā)生改變，以降低其與配體之間的親和力，將吸附的大分子從層析柱上洗脫下來(lái)。專(zhuān)一性洗脫選用與配體結(jié)合能力更大物質(zhì)的洗脫液。eg.底物配體：底物類(lèi)似物、酶抑制劑等整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%7幾種特殊的親和層析：免疫親和層析：根據(jù)生物大分子的抗原決定部位與其抗體的結(jié)合部位之間專(zhuān)一性相互作用進(jìn)行層析的技術(shù)。共價(jià)親和層析：層析材料進(jìn)與樣品中的一個(gè)成分發(fā)生專(zhuān)一性共價(jià)反應(yīng)，使其保留在層析材料上。分離過(guò)程是依靠共價(jià)鍵的形成和斷裂來(lái)實(shí)現(xiàn)的。固定化金屬離子親和層析：利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價(jià)金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價(jià)金屬離子可以與流動(dòng)相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類(lèi)似物發(fā)生特異螯合作用而進(jìn)行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（如何用親和層析分離純化蛋白酶）1、前處理：去脂肪、結(jié)締加酸化水搗碎勻漿，提取過(guò)濾，濾液調(diào) pH過(guò)濾，濾液調(diào) pH，激活調(diào)至 pH，過(guò)濾，保存2、配體：粗提 雞卵類(lèi)粘蛋白離子交換層析精分離透析除鹽析出，干燥3、親和層析：抑制劑（雞卵類(lèi)粘蛋白）偶聯(lián)至載體（凝膠）裝柱上樣洗脫附參考資料：親和層析法純化胰蛋白酶操作步驟(一) 載體SePharose4B 的活化1環(huán)氧氯丙烷活化法：取適量的 sepharose 4B，于 G3 玻璃燒結(jié)漏斗( 簡(jiǎn)稱 G3 漏斗)上抽去保護(hù)液。稱 10g(濕重)Sepharose 4B，用 100mL0.5mol/L 氯化鈉溶液淋洗，除去 56Pha rose 4S 凝膠內(nèi)的保護(hù)劑，用蒸餾水洗凈，轉(zhuǎn)移到 100mL 的錐形瓶?jī)?nèi)。然后加入 6.5mL 2.0moLL 氫氧比鈉溶液、1.5mL 環(huán)氧氯丙烷、15mL 561，4 二氧六環(huán)，于 45的恒溫水浴搖床內(nèi)振蕩活化 2小時(shí)。然后將活化的凝膠轉(zhuǎn)移到 G3 漏斗內(nèi)抽干，用蒸餾水洗至 pH8.0 左右，再用 20mL 0.1mol/L，pH9.5 碳酸鈉緩沖液淋洗。處理完畢后立即偶聯(lián)。2溴化氰活化法：稱取 10g Sepharose 4B(濕重 )，凝膠處理方法與 1 相同，把 SePharose 4B 凝膠轉(zhuǎn)移到一個(gè)100mL 的燒杯中( 以下操作步驟必須在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行) 。加入 15mL 0.2mol/LpH10.0 的碳酸鈉緩沖液，然后將燒杯放置冰浴中，用電磁攪拌器慢慢攪拌。戴上膠皮手套，小心稱取 3g 溴化氰，加入 3mL 乙腈將溴化氰溶解。取一支滴管向燒杯內(nèi)滴加溴化氰使它與 Sepharose 4B 反應(yīng)，同時(shí)取另一支滴管向燒杯內(nèi)滴加 6mol/L 的氫氧化鈉使反應(yīng)體系的 pH 值保持在 pH10.0 左右(在酸度計(jì)上校正)，待溴整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%8化氰加完以后繼續(xù)攪拌，反應(yīng) 5 分鐘。此時(shí)反應(yīng)體系的 pH 值不再下降，仍維持在 pH10.0左右，停止反應(yīng)。迅速轉(zhuǎn)移到 G3 漏斗內(nèi)抽濾，抽濾瓶?jī)?nèi)應(yīng)預(yù)先加入一定量的固體硫酸亞鐵，以破壞濾液中未反應(yīng)的溴化氰。用 200mL 預(yù)冷的蒸餾水淋洗，最后浸泡在 20mL 0.1mol/LpH9.5，碳酸鈉緩沖液中，處理完成后立即偶聯(lián)。3配基雞卵類(lèi)粘蛋白的偶聯(lián)：將已經(jīng)活化處理好的 Sepharose 4B 轉(zhuǎn)移到一個(gè) 50mL 的錐形瓶?jī)?nèi)。然后取I0mL0.1mol/L，pH 9.5 的碳酸鈉緩沖液將約 150mg 的雞卵類(lèi)粘蛋白溶解，取出 0.1mL 蛋白溶液稀釋 30 倍，在紫外分光光度儀上測(cè)定 A280。根據(jù)消光系數(shù) A4.13 計(jì)算出偶聯(lián)前的蛋白含量。再將 9.9mL 蛋白溶液加入到盛有活化 Sepharose 4B 的三角瓶?jī)?nèi)，混勻，在4045的恒溫水浴搖床內(nèi)振蕩偶聯(lián) 2024 小時(shí)左右，終止偶聯(lián)。將凝膠轉(zhuǎn)移到 G3 漏斗內(nèi)，用 100mL 0.5mol/L 的氯化鈉溶液抽濁、淋洗，以除去未被偶聯(lián)的雞卵類(lèi)粘蛋白。取一個(gè)干凈的抽濾瓶收集濾波，測(cè)定濾液 A280，計(jì)算出末被偶聯(lián)蛋白的量，然后用 100mL 的蒸餾水洗，用 50mL 0.1mol/L 甲酸0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5 甲酸混合液洗，最后用蒸餾水洗至約 pH6.5 即可。將凝膠轉(zhuǎn)移至 50mL 小燒杯內(nèi)，用 30mL 0.5mol/L 氯化鉀0.05mol/L 氯化鈣 0.1mol/L、pH7.8TrisHCL 緩沖液浸泡 20 分鐘。脫氣后裝柱或置 4冰箱保存。(二) 胰蛋白酶粗操液的制備取 50g 豬新鮮胰臟(除去脂肪和結(jié)締組織 )剪碎置于高速組織搗碎 機(jī)內(nèi)，加入 200mL 預(yù)冷的pH2.53.0 的乙酸酸化水，勻漿。于 10提取 4 小時(shí)以上，4 層紗布過(guò)濾，收集濾液并用5mol/L 的氫氧化鈉 調(diào)至 PH8.0，加入終濃度為 0.1mol/L 氯化鈣及 12mg 胰蛋白酶晶種，置 4激活 1216 小時(shí)或在室溫(25左右) 激活 24 小時(shí) 。待胰蛋白酪比活達(dá)到 10001500 BAEE 單位mg 以后，用 6mol/L 硫酸調(diào)至 pH3.0 停止激活 。放置 4冰箱內(nèi)備用。測(cè)定胰蛋白酶活性。(三)親和層析純化胰蛋白酶取一支層析柱(10mm100mm)，裝入少量親和柱平衡液(0.5mol/L 氯化鉀0.05mol/L 氯化鈣 0.1mol/L，pH7.8 TrisHCl 緩沖液)，將親和吸附劑一次裝入柱內(nèi)，待親和吸附劑自然沉降至約 1/2 總體積后，調(diào)節(jié)合適的流速。用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀檢測(cè)流出液待基線達(dá)到穩(wěn)定后即可。取一定體積的蛋白酶粗提液(3050mL ，視酶液的蛋白濃度及比活而定)調(diào)至 pH8.0用濾紙過(guò)濾，取濾液上柱吸附，然后用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀檢測(cè)流出液，待基線達(dá)到穩(wěn)定后改用親和柱洗脫液(0.1mol/L 甲酸0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5 混合液) 洗脫。收集洗脫峰 2，測(cè)定酶蛋白含量及活性，層析圖譜，如圖 39。圖 39 親和層析純化胰蛋白酶洗脫曲線平衡液：0.5mol/L 氯化鉀，0.05mol/L 氯化鈣，0.1mol/L，pH7.8Tris-HCl 緩沖液。整理：許智潤(rùn) 2011 年末考試覆蓋率 100%9洗脫液：0.1mol/L 甲酸，0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5 混合液。(四) 胰蛋白酶的保存經(jīng)親和層析分離得到的胰蛋白酶，一般是比較純的酶，但是酶蛋白的濃度往往很低。通?？捎?pH5.0 的乙酸透析除去溶液中的無(wú)機(jī)鹽，然后冰凍干燥成粉末，長(zhǎng)期保存。也可將酶溶液放在20的冰箱冰凍保存或者在 4，pH3.0 的酸性溶液中保存，可保存兩年左右。蛋白質(zhì)電泳的牽引力（遷移率）與什么有關(guān)系蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)：分子的電荷、大小和形狀。電場(chǎng)：與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強(qiáng)度：緩沖液離子強(qiáng)度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動(dòng)速度會(huì)減緩。支持介質(zhì)：紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。為什么 SDS-PAGE 電泳只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)系在蛋白質(zhì)中加入摩爾比為 1.4：1(SDS:蛋白質(zhì)) 的 SDS(十二烷基硫酸鈉) 。使所有蛋白質(zhì)都帶上負(fù)電。SDS 是陰離子去污劑，能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，并且把大部分蛋白質(zhì)拆成組成他的亞基形式。在上樣緩沖液中加入巰基乙醇，可以使二硫鍵還原為巰基。使不同的蛋白質(zhì)分子的短軸一致，長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。SDS-PAG 中，蛋白質(zhì)電泳的速度不再取決于蛋白質(zhì)的電荷與形狀，只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。自己補(bǔ)充：PAGE 根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi)，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液 pH 值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性 ，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。注意：電泳結(jié)果顯示的只是亞單位的大小，同時(shí)蛋白質(zhì)也會(huì)失去原來(lái)的活性。有些蛋白質(zhì)不能用 SDS-PAGE 測(cè)定分子量（某些糖蛋白以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白）3 種電泳（等電聚集電泳、雙向電泳、免疫印跡法）的概念等電聚集電泳（精細(xì)，適用分析鑒定，抵消擴(kuò)散使富集，不適用于等電點(diǎn)處沉淀變性蛋白）書(shū)上：利用某些兩性電解質(zhì)支持物在電場(chǎng)中形成 pH 梯度，使蛋白質(zhì)樣品在與它們等電點(diǎn)相應(yīng)的 pH 區(qū)域