016 前 言本標準代替003食品中煙酸的測定、010食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品種煙酸和煙酰胺的測定和008肉與肉制品維生素010相比,主要變化如下:標準名稱修改為“食品安全國家標準 食品中煙酸和煙酰胺的測定”;調(diào)整了試劑順序和格式;修改并細化了適用于不同食品種類的前處理方法(第一法);增加了標準溶液濃度校正方法(第二法);重新評估了檢出限,增加了定量限。0161 食品安全國家標準食品中煙酸和煙酰胺的測定1 范圍本標準規(guī)定了食品中煙酸和煙酰胺的測定方法。本標準第一法為微生物法,適用于各類食品包括以天然食品為基質(zhì)的強化食品中煙酸和煙酰胺總量的測定;第二法為高效液相色譜法,適用于強化食品中煙酸和煙酰胺的測定。第一法 微生物法2 原理煙酸(煙酰胺)是植物乳桿菌長所必需的營養(yǎng)素,在一定控制條件下,利用植物乳桿菌對煙酸和煙酰胺的特異性,在含有煙酸和煙酰胺的樣品中生長形成的光密度來測定煙酸和煙酰胺的含量。3 試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規(guī)定的二級水。培養(yǎng)基可購買符合測試要求的商品化培養(yǎng)基。種植物乳桿菌或其他有效標準菌株。酸(氧化鈉(化鈉(硫酸(醇(酸溶液(1):吸取831000917勻。酸溶液():吸取鹽酸溶液(0水溶解至100 氫氧化鈉溶液(1):稱取40水溶解并稀釋至1000勻。0162 氧化鈉溶液():吸取氫氧化鈉溶液(0水溶解至100 生理鹽水(:稱取9解于1000裝1021滅菌15用。醇溶液(25%):量取200 硫酸溶液(1):于2000取56水稀釋到1000酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基: 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基: 煙酸測定用培養(yǎng)基:一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好,商品化合成培養(yǎng)基按標簽說明進行配制。準品煙酸(純度或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)。酸標準儲備液(乙醇溶液溶解并移至500容,混勻于24冷藏。此溶液每毫升相當于100 煙酸標準中間液(1g/)置于100乙醇溶液稀釋并定容至刻度,混勻于24冷藏。此溶液每毫升相當于1 煙酸標準工作液(100ng/)置于50水稀釋定容至刻度,混勻于24冷藏。此溶液每毫升相當于100 平:質(zhì)設(shè)備:用于試樣的均質(zhì)化。溫培養(yǎng)箱:361。旋振蕩器。力蒸汽消毒器:121(心機:轉(zhuǎn)速2000r/.7 度光光度計。凈工作臺。聲波振蕩器。注:玻璃儀器使用前,用活性劑(月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可)對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進行清洗,清洗之后烘干,于170干熱3 0163 備菌種的制備將菌種植物乳桿菌接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中,在361恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h24h,取出后放入24冰箱中保存。每月至少傳種一次,作為儲備菌株保存。實驗前將儲備菌株接種至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中,在361恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h24于接種液的制備。保存數(shù)周以上的儲備菌種,不能立即用作接種液制備,實驗前宜連續(xù)傳種2代3代以保證菌株活力。種液的制備試驗前一天,從乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基移取部分菌種于滅菌的10361恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h18h。在無菌條件下離心該培養(yǎng)液15去上清液。加入10旋渦混合器上快速混合均勻,離心15去上清液。重復離心和清洗步驟三次。以第三次細胞分散液中吸取1其充分混合均勻制成混懸液,備用。用721分光光度計,在550理鹽水為參比,讀取該菌懸液的透光值,理鹽水或第三次細胞分散液調(diào)整透光值,使其范圍在60%80%之間。立即使用。樣制備谷薯類、豆類、堅果(去殼)等試樣需粉碎、研磨、過篩(乳粉、米粉等試樣混勻;肉、蛋、魚、動物內(nèi)臟等用打碎機制成食糜;果蔬、半固體食品等試樣需勻漿混勻;液體試樣用前振搖混合。如不能馬上檢測,于4冰箱保存。樣提取準確稱取約煙酸試樣,一般乳類、新鮮果蔬試樣2g5g(谷類、豆類、堅果類、內(nèi)臟、生肉、g(液態(tài)試樣5g;乳粉、米粉等準確稱取適量試樣2g(一般營養(yǎng)素補充劑、g;液體飲料或流質(zhì)、半流質(zhì)試樣5g10入被檢驗物質(zhì)干重10倍的硫酸溶液。在121下,水解30水定容至100無灰濾紙過濾,濾液備用。釋根據(jù)試樣中煙酸含量用水對試樣提取液進行適當稀釋(f),0000500050000000表1?；靹颉Ｃ總€標準點應(yīng)制備3管。0164 表1 標準曲線管的制作試管號(12345678910蒸餾水/中不添加標準溶液;2中滴加菌液;0中添加標準品溶液的濃度依次增高。3個重復。樣系列管取4支試管,表2?；靹?每個濃度做3個重復。表2 試樣管的制作試管號(1234蒸餾水/菌將所有的標準系列管和試樣系列管測定管塞好棉塞,于121(壓滅菌5菌完成后,迅速冷卻,備用。種:在無菌操作條件下,將接種液轉(zhuǎn)入無菌滴管,向每支測定管接種一滴。養(yǎng):將加完菌液的試管置于361恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h24h,直至獲得最大濁度,即再培養(yǎng)2準備一支標準0管(接種作為0對照管。定用厚度為1波長550培養(yǎng)好的測定管用渦旋混勻器混勻。以未接種0對照管調(diào)節(jié)透光率為100%,然后依次測定標準系列管、試樣系列管的透光率。取出最高濃度標準曲線管振蕩5s,測定光密度值,放回重新培養(yǎng)。2果兩次光密度的絕對差結(jié)果2%,則取出全部檢驗管測定標準溶液和試樣的光密度。準曲線的制作以標準系列管煙酸含量為橫坐標,光密度值為縱坐標,繪制標準曲線,也可對各個標準點做擬合曲線。各個標準點3管之間的光密度值的相對標準偏差應(yīng)小于10%,如果某一標準點3支試樣管中有2支煙酸含量落在5000該兩管之間折合為每毫升試樣提取液中煙酸含量的偏差小于10%,則該結(jié)果可用,如果3支試樣管中煙酸含量的相對標準偏差大于10%,則該點舍去,不參與標準曲線的繪制。0165 6 分析結(jié)果的表述試樣結(jié)果計算:從標準曲線查得試樣系列管中煙酸的相應(yīng)含量(c),按式(1)進行結(jié)果計算。測定液濃度按式(1)計算:X=V1001000(1)式中: X 試樣中煙酸含量,單位為毫克每百克(00g);試樣系列管折合為試樣提取液中煙酸濃度平均值,單位為納克每毫升(ng/試樣提取液定容體積,單位為毫升(f試樣提取液稀釋倍數(shù);m試樣質(zhì)量,單位為克(g);1001000折算成每百克試樣中煙酸毫克數(shù)的換算系數(shù)。結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。7 精密度普通食品在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%;強化食品在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的5%。8 其他按樣品種類將待測試樣稀釋到線性范圍內(nèi)再對樣品進行測試。本標準試管法線性范圍50ng/00ng/然類等含量較低的食品試樣稱樣量為500g,00g;強化食品等含量較高的食品試樣稱樣量為100g,00g。第二法 高效液相色譜法9 原理高蛋白樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì),高淀粉樣品經(jīng)淀粉酶酶解,在弱酸性環(huán)境下超聲波振蕩提取,以紫外檢測器檢測261據(jù)色譜峰的保留時間定性,外標法定量,計算試樣中煙酸和煙酰胺含量。10 試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規(guī)定的一級水。酸(優(yōu)級純。0166 氧化鈉(優(yōu)級純。氯酸(體積分數(shù)為60%,優(yōu)級純。醇(色譜純。丙醇(色譜純。烷磺酸鈉(色譜純。粉酶:酶活力酸():用量筒量取4151000585勻。酸():1000勻。氧化鈉():稱取200)于燒杯中加水溶解并轉(zhuǎn)移至1000水定容,混勻。氧化鈉():)于燒杯中加水溶解并轉(zhuǎn)移至1000水定容,混勻。動相:甲醇70丙醇20烷磺酸鈉1g,用910酸和煙酰胺標準溶液煙酸(煙酰胺(純度99%,或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)。酸和煙酰胺標準儲備液(分別置于100鹽酸溶解,定容至刻度,混勻(4冰箱中可保存1個月)。注:標準儲備液配制完以后,需要進行濃度校正,校正方法見附錄B。酸和煙酰胺標準混合中間液(準確吸取煙酸和煙酰胺標準儲備液(水定容至刻度,混勻。臨用前配制。酸和煙酰胺標準混合工作液:分別準確吸取標準混合中間液(水定容至刻度,混勻,用前配制。11 平:箱培養(yǎng)箱:3080。聲波振蕩器。11.4 度效液相色譜儀:帶紫外檢測器。次性微孔濾頭:2 樣制備與處理非粉狀固態(tài)試樣粉碎并混合均勻;液態(tài)試樣搖勻。0167 粉類和含淀粉的食品(即食谷物、面包、餅干、面條、小麥粉和雜糧粉等制品)加入約2550的水,150勻后向錐形瓶中充氮,蓋上塞,置于5060的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約30出冷卻至室溫。注:如果條件允許,建議酶解時采用555水浴振搖。含淀粉的食品(調(diào)制乳、調(diào)制乳粉、飲料類、固體飲料類、豆粉和豆?jié){粉等制品)加入約2550的水,150于超聲波振蕩器中振蕩約10置50冷卻至室溫。取待試樣溶液降至室溫后,置約2于50水浴超聲波振蕩器中振蕩10卻至室溫后轉(zhuǎn)至100水反復沖洗錐形瓶,洗液合并于100水定容至刻度后混勻,經(jīng)濾紙過濾。樣品瓶收集,即為試樣測定液。注:必要時,試樣測定液用水進行適當?shù)南♂?f),使試樣測定液中煙酸和煙酰胺濃度在1g/0g/考液相色譜條件參考液相色譜條件列出如下:a) 色譜柱:徑5m,250具有同等性能的色譜柱;b) 柱溫:25c) 紫外檢測器:檢測波長為261nm;d) 流動相:甲醇70丙醇20烷磺酸鈉1g,用910e) 流速:f) 進樣量:10準曲線測定按照已經(jīng)確立的色譜條件,將煙酸及煙酰胺混合標準系列測定液依次按上述推薦色譜條件進行測定(記錄各組分的色譜峰面積或峰高,以峰面積或峰高為縱坐標,以標準測定液的濃度為橫坐標,繪制標準曲線。樣溶液的測定將試樣測定液按上述推薦色譜條件進樣測定。記錄各組分色譜峰面積或峰高,根據(jù)標準曲線計算出試樣測定液中煙酸及煙酰胺各組分的濃度。0168 13 樣煙酸和煙酰胺含量計算試樣中煙酸或煙酰胺的含量,按式(2)計算:iV100m(2)式中:試樣中煙酸或煙酰胺的含量,單位為微克每百克(g/100g);試樣待測液中煙酸或煙酰胺的濃度,單位為微克每毫升(g/V試樣溶液的體積,單位為毫升(m試樣的質(zhì)量,單位為克(g)。注:液態(tài)試樣中煙酸或煙酰胺含量也可以微克每百毫升(g/100單位。樣中維生素式(3)計算:X=2(3)式中:X 試樣中維生素位為微克每百克(g/100g);試樣中煙酸的含量,單位為微克每百克(g/100g);試樣中煙酰胺的含量,單位為微克每百克(g/100g);煙酰胺轉(zhuǎn)化成煙酸的系數(shù)。果表述結(jié)果保留到整數(shù)。14 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。15 其他當稱樣量為5酸檢出限為30g/100g,定量限為100g/100g,煙酰胺檢出限為40g/100g,定量限為120g/100g。0169 附 錄 法先將除瓊脂以外的其他成分溶解于蒸餾水中,025),再加入瓊脂,加熱煮沸,使瓊脂融化。混合均勻后分裝試管,每管1021高壓滅菌15用。法將上述成分溶解于水中,025),分裝1021高壓滅菌15用。01610 行配