2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,1,第十章 繁殖新技術(shù),第四節(jié) 克隆技術(shù) 第五節(jié) 性別鑒定與控制 第六節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 第七節(jié) 胚胎干細(xì)胞,第19講,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,2,第四節(jié) 克隆技術(shù),2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,3,一、胚胎分割技術(shù),概念：同卵雙生或同卵多生 意義：擴(kuò)大胚胎來源；充分利用優(yōu)良種公、母畜,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,4,胚胎分割基本過程,代孕母牛,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,5,一、胚胎分割技術(shù), 顯微操作儀分割 在操作儀操縱下，左側(cè)用固定吸管固定胚胎，右側(cè)用切割刀（針）的切割部位放在胚胎的正上方，并垂直施加壓力，當(dāng)觸到平皿底時(shí)，稍加來回抽動(dòng)，即可將胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)從中央等分切開，也可以只在透明帶上作一切口，切割并吸出半個(gè)胚胎 成功率高，但需要昂貴的儀器設(shè)備。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,6,胚胎分割所用到的儀器,顯微操作儀分割,徒手分割,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,7,一、胚胎分割技術(shù), 徒手分割 0.1-0.2%鏈霉蛋白酶軟化透明帶 放置于微滴中,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,8,胚胎分割,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,9,分割半胚,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,10,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,廣義的克?。o性繁殖）,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,12,“多莉”doly,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,13,細(xì)胞核移植,概念：將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過精子穿透等有性過程即無性繁殖就可被激活、分裂并發(fā)育成新的個(gè)體使得核供體的基因得到完全復(fù)制 胚細(xì)胞核移植：容易 體細(xì)胞核移植：困難,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,14,細(xì)胞核移植步驟,程序： 供體核的分離技術(shù) 受體細(xì)胞的去核技術(shù) 核卵重組技術(shù) 重組胚的融合技術(shù) 核移植胚激活、培養(yǎng)、移植或重復(fù)克隆技術(shù),2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,15,1供體核的分離技術(shù),（1）胚細(xì)胞 透明帶軟化 （2）體細(xì)胞 G0/G1期 （3）胚胎干細(xì)胞 G0/G1期,血清饑餓法,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,16,2受體細(xì)胞的去核技術(shù),（1）一步法（盲取法）,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,17,2受體細(xì)胞的去核技術(shù),（2）透明帶切開法（兩步法）,透明帶切口：用切口針撥動(dòng)使第極體（Pb）位于12點(diǎn)的位置，從上部刺入并經(jīng)Pb基部刺穿對側(cè)透明帶；用固定針下緣來回摩擦23次，切開透明帶； 去核：a. 直接去核：用平頭吸管自切口處插入，連同Pb及其下方約1/41/3胞質(zhì)去掉。b. 擠壓法去核：將Pb重新固定于12點(diǎn)位置，用平頭吸管自固定管對側(cè)擠壓卵，則Pb及其下方部分胞質(zhì)被擠出。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,18,3核卵重組技術(shù),卵周隙注射：在顯微操作儀操縱下，用去核吸管吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去除核的受體卵母細(xì)胞的卵周隙中 胞質(zhì)內(nèi)注射：先將供體細(xì)胞的核膜捅破，形成核胞體，再將核胞體直接注入到去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，然后進(jìn)行激活處理,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,19,4重組胚的融合技術(shù),（1）仙臺病毒法 （2）電融合法,電融合儀,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,20,5核移植胚的激活、培養(yǎng)、移植,融合后的重組胚經(jīng)化學(xué)激活或電激活后，在體外培養(yǎng)或經(jīng)過中間受體培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚，然后移入與胚齡同期的受體動(dòng)物子宮角內(nèi)，獲得克隆后代,獲得的早期胚也可作為供體核重新克隆,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,21,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,22,治療性克隆技術(shù),2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,23,三、動(dòng)物克隆技術(shù)的應(yīng)用前景,作為胚胎發(fā)生、死亡及其調(diào)控，細(xì)胞核與胞質(zhì)間的關(guān)系等的研究手段 為科學(xué)研究提供大量遺傳性狀一致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 優(yōu)秀種公、母畜的純種快速繁育擴(kuò)群 拯救珍貴瀕危動(dòng)物，我國利用異種動(dòng)物克隆技術(shù)，已克隆出了大熊貓囊胚 克隆復(fù)制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，建立生物工廠,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,牛 胚 胎 移 植 和 克 隆,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,25,四、克隆技術(shù)存在的問題,理論問題 分化的體細(xì)胞克隆對遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過程）的機(jī)理還不清楚； 克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡。 克隆動(dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基因。 在克隆過程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,26,實(shí)踐問題 克隆動(dòng)物的成功率還很低 生出的部分個(gè)體表現(xiàn)出生理或免疫缺限 即使是正常發(fā)育的“多莉”，也被發(fā)現(xiàn)有早衰跡象,四、克隆技術(shù)存在的問題,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,27,除了以上的理論和技術(shù)障礙外，克隆技術(shù)（尤其是在人胚胎方面的應(yīng)用）對倫理道德的沖擊和公眾對此的強(qiáng)烈反應(yīng)也限制了克隆技術(shù)的應(yīng)用。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,28,在畜牧生產(chǎn)中， 為什么要對動(dòng)物進(jìn)行性別鑒定或性別控制？,第五節(jié) 性別鑒定與控制,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,29,一、性別鑒定的方法,（一）細(xì)胞遺傳學(xué)方法 1核型分析法 X、Y染色體在形態(tài)上的差異。 準(zhǔn)確率幾乎是100% , 耗時(shí)太長。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,30,一、性別鑒定的方法,（一）細(xì)胞遺傳學(xué)方法 2X-連接酶測定法 測定X染色體有關(guān)的酶的活性的高低。 短暫時(shí)期內(nèi)，雌性的兩條X染色體都可以被轉(zhuǎn)錄和翻譯，雌性胚胎中與X染色體相關(guān)酶的細(xì)胞內(nèi)濃度及活性是雄性胚胎的兩倍。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,31,一、性別鑒定的方法,（二）SRY基因探針法 1990 年，英國學(xué)者 Sinclair 和 Gubbay發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物Y 染色體短臂上靠近常染色體區(qū)的 35Kb 區(qū)域存在性別決定區(qū)， 即 SRY 基因。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,32,熒光原位雜交 (Fish) 探針首先與報(bào)告分子（reporter molecular）結(jié)合、雜交，雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接熒光染料而進(jìn)行標(biāo)記。 12枚分裂球 , 2h。 陽性，則胚胎為雄性胚胎，反之，則為雌性胚胎。,一、性別鑒定的方法,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,33,（三）PCR法性別鑒定 PCR擴(kuò)增Y染色體上SRY基因的檢測技術(shù)。 胚胎分割結(jié)合，幾個(gè)細(xì)胞即可檢測。 有條帶為雄性胚胎，無條帶為雌性胚胎。,一、性別鑒定的方法,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,34,PCR結(jié)果圖示,樣品孔,內(nèi)標(biāo),雄性特異條帶,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,35,1、精子鑒定及分離 X-精子、Y-精子（吸附、電泳） 2、個(gè)體鑒定 染色體（組型） Y-染色體（SRY 探針法）,二、性別控制的方法,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,36,1、流式細(xì)胞分類術(shù)分離精子,(一) 流式細(xì)胞術(shù)分離X精子和Y精子理論基礎(chǔ),DNA含量不同 X精子DNA含量大于Y精子 人的X精子染色體的DNA含量大約比Y精子的多2.8%3.0%,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,37,1、流式細(xì)胞分類術(shù)分離精子,（二）流式細(xì)胞術(shù)分離X精子和Y精子工作原理,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,38,1、流式細(xì)胞分類術(shù)分離精子,（三）精確性與有效性評價(jià) 流式細(xì)胞術(shù)分離X精子和Y精子的純度能達(dá)到90%左右。 Johnson（1989）等對分離精子對母兔宮內(nèi)受精，其中用X精子受精產(chǎn)下的仔兔中94%是母兔，由Y精子受精產(chǎn)下的仔兔中81%是公兔。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,39,1、流式細(xì)胞分類術(shù)分離精子,（三）精確性與有效性評價(jià) Johnson（1991）等又對豬做同樣的處理，結(jié)果分別產(chǎn)下了74%的雌性和68%的雄性仔豬。 Cran（1993）和Seidel（1997）等報(bào)道，用分離的Y精子進(jìn)行人工受精（AI）或體外受精（IVF）和胚胎移植（ET）后產(chǎn)下的67頭犢牛中，90%為公犢牛，用分離的X精子做相同的處理后產(chǎn)下139頭犢牛，其中83%為母犢牛。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,40,三、流式細(xì)胞分類術(shù)分離精子,（四）優(yōu)缺點(diǎn) 準(zhǔn)確性高 分離速度慢 儀器昂貴，成本高,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,41,第六節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù),1、概念 轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是用實(shí)驗(yàn)室方法將所需要的目的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵，使外源基因與動(dòng)物本身的基因整合在一起，在動(dòng)物發(fā)育過程中表達(dá)，并能穩(wěn)定地遺傳給后代的技術(shù)。這種在基因組中穩(wěn)定地整合有人工的外源基因的動(dòng)物稱轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenetic animal，TA）,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,42,你吃過轉(zhuǎn)基因食品嗎？ 不管您愿不愿意，您己經(jīng)或正在把轉(zhuǎn)基因食品吃進(jìn)肚里,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,43,國內(nèi)尚沒有轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模生產(chǎn) 近幾年，我國大量從美國、阿根廷等國進(jìn)口大豆，其中大部分是轉(zhuǎn)基因大豆 我國有一半以上的大豆色拉油含有轉(zhuǎn)基因成分,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,44,第一批列入目錄的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物是： 大豆：大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕 玉米：玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉 油菜：油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕 棉花: 棉花種子 番茄：番茄種子、鮮番茄、番茄醬,現(xiàn)在國內(nèi)都有哪些轉(zhuǎn)基因食品？,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,45,現(xiàn)在市場上常見的小西紅柿算是 轉(zhuǎn)基因食品么？,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,46,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物生產(chǎn)改良、培育新品種和提高生產(chǎn)性能，進(jìn)行基因治療 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制造具有生物活性的產(chǎn)物，包括器官移植和生物反應(yīng)器 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物確定研究手段，包括建立疾病模型和發(fā)育調(diào)控,2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,47,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,48,外源目的基因的制備 外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞 選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞 選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定 篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系,3、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù),2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,49,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)方法示意圖,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,50,基因顯微注射法 胚胎干細(xì)胞移植法 反轉(zhuǎn)錄病毒法,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,51,1982年美國華盛頓大學(xué)Palmiter等將大鼠生長激素基因?qū)胄“资蟮氖芫牙?，再將這一受精卵植入借腹懷孕的母鼠體內(nèi)，生下一個(gè)比正常體格大一倍的“超級小鼠”。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,52,通過DNA顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠示圖,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,53,顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成活率,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,54,胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell）,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,55,胚胎干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因小鼠,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,56,反轉(zhuǎn)錄病毒載體獲得轉(zhuǎn)基因小鼠,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,57,轉(zhuǎn)基因牛,從屠宰場殺掉的奶牛體內(nèi)收集卵母細(xì)胞，體外成熟； 用公牛精液對成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精； 受精卵離心，濃縮卵黃； 將欲導(dǎo)入的DNA微注射到核中； 對胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)； 利用非外科移植術(shù)將一個(gè)胚胎； 植入發(fā)情的代孕母牛子宮內(nèi)； 對子代進(jìn)行檢測，確定是否轉(zhuǎn)入基因。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,58,轉(zhuǎn)基因綿羊、山羊和豬,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,59,轉(zhuǎn)基因禽類,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,60,轉(zhuǎn)基因魚,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,61,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,62,4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究面臨的問題,整合效率低，成本高 表達(dá)不理想 轉(zhuǎn)基因給動(dòng)物造成插入突變和機(jī)能紊亂 產(chǎn)品的安全性問題,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,63,5、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究新進(jìn)展,（一）性腺轉(zhuǎn)基因方法 （性腺直接注射法）,（二）定點(diǎn)制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法,（三）外源目的基因的表達(dá)和調(diào)控 （特異性）,（四）轉(zhuǎn)入干擾基因進(jìn)行RNA干擾 （RNAi）調(diào)控,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,64,講座,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,65,第七節(jié) 哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,66,1、 概念,胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）是一種從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)分離、體外培養(yǎng)、克隆等得到的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。,2019/5/14,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,67,2 、胚胎干細(xì)胞, Blastocyte inner cell mass: