第四章 生物免疫分析技術,免疫分析 利用抗體與抗原的特異性結合作用來選擇性地識別和測定作為待測物的抗體和抗原，因為樣品中其他干擾化合物不產(chǎn)生免疫性識別，因此免疫反應的選擇性非常高。,免疫學方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運用，其中酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）已經(jīng)在食品工業(yè)中廣泛應用，它能夠用于測定人們希望含有的物質(zhì)，以及不希望含有的物質(zhì)。例如現(xiàn)在人們所關注的食品安全性問題中一些物質(zhì)的檢測：殺蟲劑、藥物殘留物、激素、生長素、微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，以及一些添加劑。 免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速和低成本的優(yōu)點；可對大量的樣品進行常規(guī)分析；能夠用于樣品的定性篩選，也能夠?qū)悠愤M行定量測定以確定樣品中待測組分的含量。,4.1 免疫的原理,Ag + Ab AgAb 特異性、靈敏性 在Ag，Ab反應中，用容易示蹤的化學物質(zhì)標記一種反應物，以了解反應是否發(fā)生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度（即對未知成分的樣品進行定性、定位及定量分析）。,4.2 酶聯(lián)免疫法,免疫酶技術：把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機地結合起來。它具有免疫熒光試驗和放射免疫試驗的優(yōu)點，并克服上述兩種方法的缺點。 酶標記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長，免疫酶技術的敏感性接近放射免疫試驗，可直接肉眼觀察也可借助簡單的儀器作定量測定，所得結果比較客觀。,酶免疫測定或免疫酶技術是指酶標記抗體或酶標記抗體進行的抗原抗體反應。它主要包括兩個方面： 免疫過氧化物酶法：以過氧化物酶作為標記，與抗原或抗體結合，然后根據(jù)酶與其底物間所產(chǎn)生的不溶性顏色產(chǎn)物，借助于光學或電子顯微鏡觀察細胞及亞細胞水平的抗原或抗體。 酶聯(lián)免疫吸附法：根據(jù)可溶性抗原或抗體與不溶性固相載體結合后，還保留其免疫活性，結合了作為標記的酶催化作用。,測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性， 然后加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性， 當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應,結合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。,顏色反應的深淺與相應的抗體或抗原量成正比，因此可借助于顏色反應的深淺來定量抗體或抗原。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。 其方法簡單，方便迅速，特異性強。,4.2.2 酶及其底物 酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應。,4.2.3 ELISA的種類和變化,（一）雙抗體夾心法 （二）間接法 （三）競爭法 （四）雙位點一步法 （五）捕獲法測IgM抗體 （六）應用親和素和生物素的ELISA,（一）雙抗體夾心法,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,步驟： A 將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗； B 加入待檢標本溶液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結合，溫育后清洗； C 加入酶標記特異性抗體，溫育后清洗； D 加入酶作用底物，產(chǎn)生顯色反應，顏色的改變與所加的待檢標本溶液中的抗原量成正比。,間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。,（二）間接法,步驟： A 將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），經(jīng)溫育后清洗； B 加入待檢稀釋血清，若血清中有相應特異性抗體存在則與吸附的抗原結合，溫育后清洗； C 加入酶標記的抗球蛋白抗體，此時酶標記抗體與吸附的抗原抗體復合物結合，溫育后清洗； D 加入酶作用底物（或稱基質(zhì)），酶分解底物并顯色，用光電比色計測定底物顯色深淺，即可推知抗體量。,（三）競爭法,此法可用于檢測小分子抗原。,步驟： A 將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗； B 將可能含抗原的待檢溶液和酶標記的已知抗原溶液以適當比例混合，加入已包被的載體孔中，溫育后清洗； C 加入酶作用的底物，產(chǎn)生顯色反應。色深表示結合的酶標記抗原多，而待檢溶液中未標記的抗原量少；反之，色淺表示結合的酶標記抗原少，而待檢溶液中抗原量多。,對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結合的結果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結合，使固相上結合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。,4.2.4 特點 特點一：靈敏性 該測定法的靈敏度來自酶。眾所周知, 酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應 ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。 例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為510g/ml 。,特點二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。,例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應的抗體結合，而不與另外兩種抗體反應。抗原抗體反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。,ELISA應用實例,飼料中鹽酸克倫特羅的測定 飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素， 簡曲霉毒素 ） 飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏菌 ）,甲胺磷殘留分析 甲基對硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析,ELISA在飼料安全檢測中的應用,ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測,河豚毒素,植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素,苯并芘,主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（ FN ）、 甲氟磷酸異已酶（ SOMAN ）、 草不綠（ Alachor ）、 西維因（ Carbaryl ）、 多菌靈及克菌丹（ Captan ）等。,農(nóng)藥的檢測：,ELISA檢測 “非典型肺炎”冠狀病毒,ELISA在結締組織病早期診斷中的應用檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風濕性關節(jié)炎（PtA）33抗體,ELISA在疾病診斷中的作用,ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體,ELISA試劑盒商業(yè)資訊,ELISA試劑盒,酶聯(lián)免疫井,DNM-9602G酶標分析儀,DNM-9602 標配酶標分析儀,DNM-9602A酶標分析儀,幾種酶標分析儀,4.3 放射免疫法,放射免疫測定（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰島素含量的測定，是一種將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反應的特異性這兩大特點結合起來的免疫標記測定技術。 其優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、精確性好、樣品用量少，而且不需要復雜的提純步驟。缺點是需要特殊的儀器設備和一定的防護條件，而且有些同位素標記物的半衰期較短以及試驗廢物難以處理，對環(huán)境造成放射性污染。,放射免疫測定法,基本原理 放射免疫測定是建立在待測抗原和標記抗原對有限量抗體進行競爭性結合的基礎上。待測抗原是指人體內(nèi)某種微量活性物質(zhì)（如微生物寄生蟲抗原、激素、維生素、酶、藥物等），而標記抗原使將已知的上述物質(zhì)標記上放射性同位素，具有示蹤作用。,將標記抗原（Ag*）和未標記抗原（Ag）與特異性抗體（Ab）相混合，結果形成標記的和未標記的抗原抗體復合物。標記和未標記的抗原競爭與抗體進行結合的現(xiàn)象，成為競爭性抑制作用。 Ag* + Ab Ag*-Ab 標記抗原 特異性抗體 標記抗原抗體復合物