第五章,植物無性系的快速繁殖,植物無性系的快速繁殖,分五個(gè)階段： 第一階段，無菌培養(yǎng)物的建立 （外植體的建立） 第二階段，誘導(dǎo)外植體生長與分化 第三階段，試管苗的增殖和繼代培養(yǎng) 第四階段，壯苗與生根 第五階段，小植株的移栽馴化,無菌培養(yǎng)物的建立,植物材料的準(zhǔn)備 源植物的預(yù)處理 植物材料的采集 植物材料的消毒 無菌操作 初代培養(yǎng)物 初代培養(yǎng)建立起來的條件 初代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問題及對策,源植物的預(yù)處理,為獲得健康、無菌的植物材料，需要在材料采集之前進(jìn)行預(yù)處理，即將源植株栽培在特殊管理的大田或溫室，或進(jìn)行室內(nèi)盆栽 如果必須從大田中采集植物材料，則須做到 采集未休眠或綻放前帶芽鱗的芽 用塑料布包裹將用的莖段或植物體部分，待長成后采集 用最幼嫩的枝條 將枝條采回后用流水沖洗。,植物材料的采集,選擇植物材料應(yīng)遵循的原則： 1、外植體再生能力強(qiáng)； 2、遺傳穩(wěn)定性好； 3、外植體來源豐富； 4、外植體滅菌容易。,植物材料的采集,植物材料的采集要考慮 消毒的難易程度 天氣、季節(jié)、生長環(huán)境、生長狀態(tài)、取材部位等 培養(yǎng)目的 組織培養(yǎng)中的反應(yīng)性 即植物材料自身因素對培養(yǎng)中生長和發(fā)育的影響，也就是培養(yǎng)的難易程度,培養(yǎng)目的,從培養(yǎng)目的講 苗木快速無性繁殖：多采用腋芽莖段、原球莖或莖尖（分生組織）作起始培養(yǎng)材料 生產(chǎn)單倍體植株：多采用花粉(藥)培養(yǎng)或未受精胚珠培養(yǎng) 生產(chǎn)植物次生代謝物：常用活體中該天然物質(zhì)含量最豐富的部位游離的細(xì)胞作起始培養(yǎng)材料,組織培養(yǎng)中的反應(yīng)性,基因型 源植株年齡 組織或器官的年齡 生理狀態(tài) 健康狀態(tài) 取材季節(jié) 生長條件 取材位置 外植體大小 損傷 外植體的極性和接種方法 預(yù)處理,基因型,雙子葉植物常比單子葉植物容易獲得再生植株，而裸子植物的再生能力則非常有限 同屬不同種，甚至同種不同品種，器官分化和植株再生能力也有很大的差異,源植株年齡,植物的胚性組織常具有較高的再生能力 隨著植物年齡的增加，其再生能力會(huì)隨之而下降 植物組織培養(yǎng)常選用幼齡植物的組織或器官作外植體,組織或器官的年齡,幼嫩柔軟(非木質(zhì)化)組織一般比年老的木質(zhì)化的組織更易于組織培養(yǎng) 在開花期，植物的再生能力都得到提高,生理狀態(tài),外植體的生理狀態(tài)顯著影響著細(xì)胞分裂狀態(tài) 一般而言，處于植物營養(yǎng)生長狀態(tài)的外植體比生殖生長時(shí)具有更強(qiáng)的再生能力,健康狀態(tài),從健康的植株上取材，培養(yǎng)成功的可能性顯然遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于不健康的植株。 在為營養(yǎng)繁殖選取外植體時(shí)，源植株的健康狀態(tài)對消毒的難易程度、培養(yǎng)的難易程度及再生植株的表現(xiàn)都有很大影響，所以要慎之又慎。,取材季節(jié),從大田栽培或野生的植物上采集外植體時(shí)，要考慮取材時(shí)的季節(jié)因素 冬季是否嚴(yán)寒(嚴(yán)寒有利于打破休眠) 夏季是否干燥(水分供應(yīng)不充足，就生長得差) 生長季節(jié)是否光照充足(光照不足，營養(yǎng)物質(zhì)貯備較少),生長條件,自然晝長和自然光照條件下生長的植物材料同溫室中甚至試管中離體培養(yǎng)的植物的培養(yǎng)反應(yīng)有所不同 與大田植物相比，生長在溫室中的植物更易伸長和黃化，在培養(yǎng)中也更容易再生,取材位置,從樹體上游分離外植體時(shí)，位置越靠上，不定根發(fā)生的可能性就越小，這是由于上部要比下部更為成熟 按照植物生理學(xué)的觀點(diǎn)，沿植物主軸，愈向上生長時(shí)間愈短，但其生理或發(fā)育特性則愈近發(fā)育成熟，也就愈可能形成花器官；而愈靠近下部則愈近發(fā)育上的幼態(tài)，不定根發(fā)生能力也愈強(qiáng),外植體大小,離體部分愈大，就愈易誘導(dǎo)其生長和再生，同時(shí)添加的營養(yǎng)和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的依賴性也有所下降 分生組織越大，存活率越高，卻對于脫除病毒不利，外植體愈小的旺盛生長的分生組織區(qū)域，病毒含量就越小或無，脫除病毒的機(jī)會(huì)也就越大 切取大小不同的傷口面積同無損傷部分的比例也應(yīng)加以考慮，因?yàn)樗鼤?huì)影響到再生能力,損傷,損傷組織對培養(yǎng)反應(yīng)影響大，因?yàn)閾p傷區(qū)域可以擴(kuò)大對營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的吸收，同時(shí)也增加乙烯的產(chǎn)生,外植體的極性和接種方法,外植體的極性也顯著影響著培養(yǎng)中的反應(yīng)，極性同某些生理活性物質(zhì)的濃度梯度有關(guān) 外植體的接種方式有兩種：有時(shí)極性方式直立，非極性方式倒置。有時(shí)非極性接種方式根和芽再生比極性接種方式更容易，也更快,預(yù)處理,原初外植體可通過預(yù)處理來改變其生理狀態(tài) 低溫處理 將外植體置于一定的溶液中(含糖、BA、GA3等或不同濃度的BA) 利用注射的方法注入生長調(diào)節(jié)物質(zhì),植物材料的消毒,植物材料的消毒,外植體消毒的步驟： 外植體取材 自來水沖洗 70酒精表 面消毒（2060s） 無菌水沖洗 消毒劑處理 無菌水充分洗凈 備用,植物材料的消毒,莖段、莖尖或葉柄、葉片表面消毒 地下根莖消毒 果實(shí)和種子消毒 花藥或未授精胚珠等消毒 注：為了增強(qiáng)消毒效果，采用如下方法： 將植物材料在滅菌前用清潔的流水(或自來水)沖洗0.52小時(shí) 向消毒劑中加入1滴或數(shù)滴吐溫(Tween)20或80，濃度為0.08一0.12，粘著劑可降低表面張力，更好地同材料表面接觸 在消毒過程中攪拌或振蕩 在真空中進(jìn)行消毒，可使氣泡排除，滅菌更有效 多種消毒劑多次消毒處理或復(fù)合消毒處理,無菌操作,無菌操作室或接種室消毒 工作人員的個(gè)人清潔衛(wèi)生 接種工作臺(tái)、接種工具、容器等的消毒 接種操作要領(lǐng),初代培養(yǎng)建立起來的條件,保證無菌 條件合適 選擇好合適的作物種類、品種及培養(yǎng)的部位 選擇好合適的培養(yǎng)基，激素及其他添加物 掌握適宜的培養(yǎng)條件 技術(shù)過關(guān),初代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問題及對策,污染 操作污染分為細(xì)菌污染和真菌污染 外植體自身帶菌導(dǎo)致的污染 由于表面滅菌不徹底或外植體內(nèi)部帶菌所致 褐變 褐變的概念及影響因素 褐變的防止方法,細(xì)菌污染,細(xì)菌污染 表現(xiàn)：在培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體、菌落或渾濁的水跡狀，有時(shí)甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀。 原因：主要是由于工作人員使用未經(jīng)充分消毒的工具、或由于呼吸排除的細(xì)菌、或操作人員用手接觸材料或器皿的邊緣，使微生物落入培養(yǎng)基中，有時(shí)也會(huì)因剪取某一帶菌材料后用具又未徹底滅菌，造成繼續(xù)污染。,真菌污染,真菌污染 表現(xiàn)：在培養(yǎng)過程中，一般35天發(fā)現(xiàn)菌絲，既而很快出現(xiàn)灰、白、黃、綠等孢子。 原因：空氣污染以及取放瓶塞揚(yáng)起的灰塵和真菌孢子落入器皿中造成。,褐變的概念及影響因素,概念 褐變是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象。 褐化的發(fā)生是由于組織中多酚氧化酶被激活，酚類化合物被氧化形成褐色的醌類物質(zhì)。醌類化合物在酪氨酸酶的作用下，與培養(yǎng)材料組織中蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起其它酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致代謝紊亂，生長受阻。 影響因素 基因型 材料的生理狀態(tài) 培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)時(shí)間,褐變的防止方法,選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w，掌握適宜的采芽時(shí)間 外植體用流水沖洗30分鐘以上，在接種前將外植體在無菌水中浸泡處理 降低對外植體的切割損傷，或在無菌水中切割 降低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度；缺省生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可減少酮類物質(zhì)分泌和氧化 使用液體培養(yǎng)基可以迅速稀釋外植體傷口處分泌出的有毒物質(zhì) 在培養(yǎng)基中加入活性炭 在培養(yǎng)基中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP 加入抗氧化劑如檸檬酸、維生素C、L半胱氨酸、硫脲 在培養(yǎng)基中添加氨基酸(谷酰胺、精氨酸、天冬酰胺)、芳香甙、硫代硫酸鈉 連續(xù)轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上有時(shí)可緩慢阻止色素的形成 由苗芽基部光激活引起的褐化可通過將苗芽基部處于黑暗狀態(tài)得以消除 控制光溫條件，避免過高,誘導(dǎo)外植體生長與分化,再分化過程的類型大體上可分為以下幾類 頂芽和腋芽的發(fā)育 不定芽的發(fā)育 體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育 原球莖的發(fā)育 原球莖是一種類胚組織，可理解為縮短的、呈珠粒狀的，由胚性細(xì)組成的類似嫩莖的器官。大部分蘭花的培養(yǎng)屬于這一類型,頂芽和腋芽的發(fā)育,頂芽和腋芽的發(fā)育方式主要有以下兩種 無菌短枝型：又稱節(jié)培法，或微型扦插法，是將待繁殖的材料，剪成單芽莖段，轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基，一定時(shí)間后可成苗，再剪成單芽莖段，繼代又可成苗（圖）。 叢生芽增殖型：莖尖或帶芽莖段在外源細(xì)胞分裂素的作用下會(huì)使休眠芽啟動(dòng)生長，形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀結(jié)構(gòu)（圖）。 注：通過頂芽和腋芽發(fā)育再生植株這種方法為多數(shù)園藝家們所推崇，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式,不定芽的發(fā)育,有兩種情況 一種是不定芽的產(chǎn)生不經(jīng)過愈傷組織階段，不定芽是從外植體受傷或沒有受傷的部位直接分化出來，這種植株的再生方式，稱器官型。 另一種是不定芽的產(chǎn)生要經(jīng)過愈傷組織階段，即從外植體上誘導(dǎo)出愈傷組織，從愈傷組織上產(chǎn)生不定芽的再生方式，稱器官發(fā)生型。 注：通過這種方式繁殖，繁殖率極高，同時(shí)也可創(chuàng)造有益的突變體。但極易發(fā)生變異，常常不能保持優(yōu)良品種的遺傳特性，在快繁中一般要避免此種器官發(fā)生方式。,試管苗的增殖和繼代培養(yǎng),植物材料在容器中培養(yǎng)一段時(shí)間后，往往需要轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上去生長。因?yàn)椋?培養(yǎng)基消耗盡 植物材料在培養(yǎng)容器中已占盡生長空間 需進(jìn)一步增殖(轉(zhuǎn)到同樣配方的培養(yǎng)基上) 植物材料轉(zhuǎn)入下一階段生長或另一種器官分化(轉(zhuǎn)到不同配方的培養(yǎng)基上) 由于無機(jī)鹽和瓊脂濃度過高而導(dǎo)致培養(yǎng)基干化 由于pH值下降而引起培養(yǎng)基流體化 防止褐化現(xiàn)象發(fā)生而轉(zhuǎn)接,試管苗的增殖和繼代培養(yǎng),繼代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問題 玻璃化現(xiàn)象 馴化作用 試管繁殖速率及其計(jì)算,試管苗的增殖和繼代培養(yǎng),試管苗繼代培養(yǎng)過程中分化再生能力衰退 原因：1、愈傷組織培養(yǎng)逐漸喪失了成器官中心；2、內(nèi)源激素的減少；3、染色體畸變。 解決措施：增加外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；篩選具有形態(tài)分生能力細(xì)胞團(tuán)；縮短繼代時(shí)間；重新建立細(xì)胞系。 影響試管苗繼代培養(yǎng)的因素 植物材料的影響 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 繼代培養(yǎng)時(shí)間長短 季節(jié)的影響 解決措施,培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察記載（P56）,1、愈傷組織誘導(dǎo)率（產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）100% 愈傷組織生長量培養(yǎng)一定時(shí)間后愈傷組織干重或鮮重接種時(shí)愈傷組織干重或鮮重 2、胚狀體誘導(dǎo)率（產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）100% 3、芽分化率（產(chǎn)生芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)） 100% 4、發(fā)根率（發(fā)根芽數(shù)/培養(yǎng)芽數(shù)）100%,玻璃化現(xiàn)象,玻璃化現(xiàn)象(vitrification) 是一種異常的生理現(xiàn)象。 玻璃化苗是植物組織培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)的半透明狀、畸形的試管苗 其解剖特點(diǎn)為：整株植物矮小腫脹，呈半透明狀。有時(shí)發(fā)育出大量短而粗的莖，節(jié)間很短或幾乎沒有節(jié)間。輸導(dǎo)組織雖可看到，但導(dǎo)管和管胞木質(zhì)化不完全。葉片厚而狹長，有時(shí)基部較寬。葉片皺縮或縱向卷曲，脆弱易折碎。葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)或蠟質(zhì)發(fā)育不完全，無功能性氣孔器。玻璃化葉片不具有柵欄組織，僅有海綿組織。,玻璃化現(xiàn)象,玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因 一般而言，培養(yǎng)條件與玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生有關(guān).培養(yǎng)條件引起試管苗碳水化合物、氮代謝和水分狀態(tài)等發(fā)生生理異常。 降低和減輕玻璃化現(xiàn)象采取的措施 增加瓊脂和(或)糖濃度 改善培養(yǎng)容器的氣體交換 改變培養(yǎng)基的大量鹽類 降低BA水平 增強(qiáng)光照，適當(dāng)降低溫度 避免采用容易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象的瓊脂種類 采用液固兩相培養(yǎng)基,玻璃化苗發(fā)生的機(jī)理,試管苗玻璃化的產(chǎn)生是由于內(nèi)源激素乙烯在代謝調(diào)節(jié)中所起的關(guān)鍵性啟動(dòng)作用。試管苗在脅迫培養(yǎng)環(huán)境中，如水勢不當(dāng)，通氣不暢、生長調(diào)節(jié)劑濃度過高、溫度過高等，導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。培養(yǎng)瓶空氣中過剩的乙烯抑制了試管苗體內(nèi)乙烯的生物合成，但誘發(fā)了其它激素質(zhì)和量的改變及酶類的變化；另外，培養(yǎng)瓶中氣體組成的改變，也影響磷酸戊糖途徑、光呼吸途徑的進(jìn)行。,馴化作用,馴化作用是指原先依賴于某種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)而生長的培養(yǎng)物，經(jīng)過一段時(shí)間的繼代培養(yǎng)后，不再需要這種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，即變成對該生長調(diào)節(jié)物質(zhì)自養(yǎng)的培養(yǎng)物的現(xiàn)象 馴化作用一般并非是永久性變化，有時(shí)培養(yǎng)條件變化也會(huì)逆轉(zhuǎn)馴化作用，所以馴化作用是外遺傳變化。 馴化作用可在繼代培養(yǎng)中自然發(fā)生，也可人為地改變培養(yǎng)條件，可以誘導(dǎo)或逆轉(zhuǎn)這種馴化作用。 馴化作用可能是由于植物組織內(nèi)對該生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成增加所致，也可能是降解速率降低或受到保護(hù)所致，組織對生長調(diào)節(jié)物質(zhì)敏感性降低也可能是一種原因，也不排除上述幾個(gè)原因共同作用的結(jié)果。,試管繁殖速率及其計(jì)算,試管苗增殖速率有理論計(jì)算和實(shí)際計(jì)算兩種 理論計(jì)算是以接種一個(gè)芽或一塊增殖的培養(yǎng)物，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)看能得到多少個(gè)芽或苗，這樣推算出理論上一年能繁殖出多少個(gè)苗 實(shí)際計(jì)算是接種一個(gè)芽或轉(zhuǎn)接一個(gè)苗，經(jīng)過一定的實(shí)際繁殖周期，看實(shí)際得到多少個(gè)成苗，然后再換算成每個(gè)周期實(shí)際繁殖的數(shù)量,試管繁殖速率及其計(jì)算,試管苗理論上一年能繁殖多少，可用下面的簡單公式計(jì)算： Y=mXn=m Xn Y=年繁殖數(shù) m =無菌母株苗數(shù) X=每個(gè)培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù) n=全年可增殖的周期次數(shù)=365/每周期的天數(shù),壯苗與生根,壯苗 材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流，使太細(xì)弱的材料達(dá)到壯苗的目的 生根（離體生根和活體生根）,離體生根,壯苗后的單苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后即可生根。 一般來說，多數(shù)植物的生根只需要一次培養(yǎng)，但有少部分植物的生根必須經(jīng)過多次培養(yǎng)才能達(dá)到目的。 一般認(rèn)為礦物元素濃度較高時(shí)有利于發(fā)展莖葉，而較低時(shí)有利于生根，所以多采用1/2或1/4量的MS培養(yǎng)基，全部去掉或僅用很低的細(xì)胞分裂素，并加入適當(dāng)?shù)纳L素。,活體生根,又稱試管外生根：芽苗先在生長素中快速浸蘸或在含有相對高濃度生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)510天，然后在溫室中栽入培養(yǎng)基質(zhì)中，并輔以高濕度環(huán)境，即經(jīng)常噴霧，幾天后，芽苗可自行生根。,小植株的移栽馴化,試管苗的特點(diǎn) 1、根與輸導(dǎo)系統(tǒng)不通 ； 2、在高濕、弱光和異養(yǎng)條件下分化和生長的葉，葉表保護(hù)組織不發(fā)達(dá)甚至完全沒有，易于失水萎焉。試管苗葉光合作用能力極低。 3、組織幼嫩、結(jié)構(gòu)較松散、細(xì)胞含水率高，機(jī)械組織不發(fā)達(dá)，容易發(fā)生機(jī)械損傷，對病蟲害特別敏感,小植株的移栽馴化,一、試管苗煉苗 1、瓶煉：試管苗在移植前必須對其進(jìn)行高光強(qiáng)鍛煉，同時(shí)將瓶口包扎物打開，使試管苗慢慢適應(yīng)外界環(huán)境，讓植株生長粗壯，增強(qiáng)小苗體質(zhì)以提高移苗成活率，這個(gè)過程叫做馴化或煉苗。 關(guān)鍵技術(shù)： 1）生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)的天數(shù)； 2）生根的狀態(tài) ； 3）煉苗時(shí)的光照強(qiáng)度 ； 4）煉苗的時(shí)間 ； 5）瓶苗開口也有技巧可言,小植株的移栽馴化,2、盤煉：從瓶中小心取出試管苗，在20度左右的溫水