主講人：馬貴紅 日期：2010-07-17,高效液相色譜儀操作方法,Waters e2695 型,什么是高效液相色譜法,High Performance Liquid Chromatography 高效液相色譜法，簡稱：HPLC 是一種基于儀器方法的高效能分離手段： 高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器 廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域： 醫(yī)藥 / 環(huán)保 / 石化 / 生命科學(xué) / 食品及農(nóng)業(yè) 在技術(shù)，理論及應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段,定量分析主要基于與標(biāo)準(zhǔn)品的比較 是其最大應(yīng)用領(lǐng)域 定性分析；不是色譜的強項 基于樣品的保留時間比較 借助于和其聯(lián)用的紫外、質(zhì)譜或其他檢測器 對定量及定性分析的要求 靈敏度、精度及準(zhǔn)確度的要求 樣品量的要求；復(fù)雜樣品的分析能力 容易使用,什么是高效液相色譜法,高效液相色譜如何工作,一個儲液瓶裝有溶劑稱為流動相，因為溶劑是流動的。 一個高壓泵溶劑傳輸系統(tǒng)或稱溶劑管理器用來產(chǎn)生和計量流動相的流速，一般是毫升/分鐘。 一個進(jìn)樣器樣品管理器或自動進(jìn)樣器可以將樣品導(dǎo)入注射連續(xù)的流動相 ，并由流動相攜帶樣品進(jìn)入高效液相色譜柱。 色譜柱裝有能獲得分離效果的填料。這種填料稱為固定相因為它被柱硬件包圍住。 檢測器用來查看化合物流出色譜柱時被分開的譜帶大多數(shù)化合物沒有顏色，所以人眼觀察不到。 流動相流出檢測器可被送至廢液瓶，或按需被收集。 當(dāng)流動相含有一個分開的化合物譜帶，高效液相色譜可以收集含有純化的化合物的該洗脫組分，用于進(jìn)一步分析。 注意高壓管路和附件用來連接泵、進(jìn)樣器、色譜柱和檢測器單元，形成流動相、樣品和化合物分離譜帶的通路。,檢測器連接計算機數(shù)據(jù)站，高效液相色譜系統(tǒng)單元先記錄電信號，再將電信號轉(zhuǎn)換為色譜圖，在顯示屏上展現(xiàn)出來。 定性和定量樣品內(nèi)溶物濃度。 由于樣品中化合物性質(zhì)差異很大，幾種類型的檢測器被開發(fā)出來。 如果一個化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收檢測器。 如果這個化合物發(fā)熒光，可使用熒光檢測器。 如果該化合物沒有上述性質(zhì)之一，可使用更廣泛的檢測器，如蒸發(fā)光散射檢測器ELSD。 最強大的方式是順序使用多個檢測器。例如，紫外和/或蒸發(fā)光檢測器可和質(zhì)譜儀MS聯(lián)用來分析色譜分離的組分。這樣，從一次進(jìn)樣，可得到分析物的更多綜合的信息。將質(zhì)譜與高效液相色譜系統(tǒng)耦合稱之為液質(zhì)聯(lián)用.,高效液相色譜如何工作,液相色譜的基本流程圖,流動相,泵,色譜柱,檢測器,泵輸液,分離,檢測,記錄,進(jìn)樣閥,進(jìn)樣,液相色譜的各部分示意圖,液相色譜實驗所需的基本參數(shù)-亦稱色譜條件 流動相：種類及配比，等度或梯度 固定相：色譜柱類型及內(nèi)徑、長短 流動相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速 檢測器參數(shù)：紫外檢測波長，靈敏度等 溫度控制 進(jìn)樣量,儀器組成及開機 溶劑管理系統(tǒng)的準(zhǔn)備 樣品管理系統(tǒng)的準(zhǔn)備 運行樣品 數(shù)據(jù)采集 報告打印 關(guān)機,Waters e2695 型高效液相色譜儀操作方法,Waters e2695 型高效液相色譜儀操作方法,儀器組成及開機 1 儀器組成 Waters e2695 分離單元 2498型紫外檢測器 色譜管理工作站 打印機,四元梯度洗脫的溶劑輸送系統(tǒng),四通道在線真空脫氣機,可容納 120 個樣品瓶的自動進(jìn)樣系統(tǒng),柱溫箱,內(nèi)置的柱塞桿密封墊清洗系統(tǒng),溶劑瓶托盤,液晶顯示器,鍵盤用戶界面及軟盤驅(qū)動器,2 開機,打開電源至on位置，開機依次接通 2695 分離單元、檢測器、計算機和打印機的電源。接通后，約 20s 儀器開始自檢，約 1min 后，顯示主屏幕，此時繼續(xù)各部件的初始化。,溶劑管理系統(tǒng)的準(zhǔn)備,流動相脫氣確認(rèn)所有溶劑管路都充滿溶劑，按【 Menu/Status 】，進(jìn)入“ Status （ 1 ）”屏幕,溶劑管理系統(tǒng)的準(zhǔn)備,必須用色譜純有機溶劑，水或緩沖鹽要用超純水； 水相流動相需要每48h重新配制，特別是100%含水流動相； 檢查6根管子是否均在液面下，必須保證6根管子全部插到溶劑瓶底部。,打開真空脫氣機（degasser）,Wet prime（執(zhí)行濕灌注）,流動相平衡色譜柱,同理溫度、流速都可在此控制面板設(shè)定！,流動相特性,（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小),流動相方面要求,除去微粒 純度的要求 超純水，梯度實驗時水中有機雜質(zhì)含量要低（建議走空白檢驗） 緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi) 緩沖液（鹽）的濃度 溶劑：色譜純，并與填料相匹配 溶劑中的雜質(zhì)含量 注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑 流動相對樣品的溶解度 有機溶劑或水的比例,流動相的轉(zhuǎn)換要緩慢 流速(壓力)的變化幅度較小，比較穩(wěn)定 溫度的變化幅度 專用色譜柱樣品及溶劑的要求,色譜柱的使用及操作,裝載樣品盤（loading carousels）： 裝入樣品與轉(zhuǎn)盤將樣品瓶插到樣品盤合適的位置，打開樣品倉門，顯示“ Door is Open ”屏幕，裝入樣品盤，按【 Next 】，直至所有樣品盤裝畢，關(guān)倉門。,樣品管理系統(tǒng)的準(zhǔn)備,樣品方面要求,溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。 儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。 除去微粒及雜質(zhì) 了解樣品在流動相中的溶解度,如樣品的溶劑不是流動相，一定要確保樣品在流動相中不析出。 了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用。,運行樣品,配置系統(tǒng)項目 管理數(shù)據(jù)（相當(dāng)于新建文件夾），鼠標(biāo)右鍵選新建，設(shè)定項目名（設(shè)定后將出現(xiàn)在運行樣品中）。 建立方法組并運行樣品 在瀏覽項目中打開你的項目，通過“新建儀器方法”來設(shè)定使用的儀器方法（即對配置系統(tǒng)一步選定的主機和檢測器進(jìn)行參數(shù)設(shè)置）：儀器方法（新建儀器方法，包括主機和選定的檢測器的參數(shù)的設(shè)置設(shè)置好選另存為保存此儀器方法關(guān)閉）此時上述編輯的儀器方法出現(xiàn)在列表中,運行樣品,在瀏覽項目中打開你的項目，通過“新建方法組”來設(shè)定具體儀器方法、處理方法、報告方法另存為“方法組”，設(shè)置方法名（與剛才的儀器方法名相統(tǒng)一）完成。,在“運行樣品”中打開設(shè)定的儀器方法，并在設(shè)針時選定設(shè)定的方法組來對樣品進(jìn)行分析。,數(shù)據(jù)處理,都可以在“瀏覽項目”中完成。 點開“瀏覽項目”，選定要要瀏覽的項目，確定后進(jìn)入的界面中有如下內(nèi)容：樣品組、進(jìn)樣、通道、方法、結(jié)果組、結(jié)果等。,PDA數(shù)據(jù)處理,在瀏覽項目中，點“通道”雙擊要處理的原始數(shù)據(jù)（點查看圖標(biāo)）進(jìn)入查看主窗口提取色譜圖點“處理方法向?qū)А眻D標(biāo)新建處理方法峰1、峰2積分區(qū)域（選定要積分的峰）給出條件剔除不要的峰純度匹配PDA光譜對照處理方法名完成（然后又出現(xiàn)主窗口，處理結(jié)果自動給出）點“方法組”圖標(biāo)，選好后點“文件”下的“另存為”“方法組”，設(shè)定即可。至此選好處理方法。 結(jié)果處理：選好數(shù)據(jù)，右鍵選處理選好方法組（上面設(shè)定好的） 點結(jié)果即可給出處理好的數(shù)據(jù) 注：通道無論什么時候給出的都是未處理數(shù)據(jù)。,FD數(shù)據(jù)處理： 點“處理方法向?qū)А眻D標(biāo)新建處理方法在新方法（方法類型中選LC）新建處理方法峰1、峰2積分區(qū)域（選定要積分的峰）給出條件剔除不要的峰處理方法名完成（然后又出現(xiàn)主窗口，處理結(jié)果自動給出） 至此選好處理方法。,色譜圖：HPLC圖形結(jié)果（Chromatogram）,色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號強度，橫坐標(biāo)為保留時間。, 色譜峰,保留時間（分）,基線 ,峰高,峰寬,響應(yīng)值,色譜圖 參數(shù)基本概念,色譜峰 Peak 色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號的微分曲線 峰底 Peak Base 峰的起點與終點之間連接的直線 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距離 峰寬 Peak Width 在峰兩側(cè)拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離 半（高）峰寬 Peak Width at Half Height 通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點之間的距離,峰面積 Peak Area 峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值 標(biāo)準(zhǔn)偏差； Standard Error 0.607倍峰高處所對應(yīng)峰寬的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿較前沿平緩的不對稱峰 前伸峰 Leading Peak 前沿較后沿平緩的不對稱峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由試樣所產(chǎn)生的峰；亦稱假峰,色譜圖 參數(shù)基本概念,基線 Baseline 在正常操作條件下，僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線 基線飄移 Baseline Drift 基線隨時間定向的緩慢變化 基線噪聲；N Baseline Noise 由各種因素所引起的基線波動 譜帶擴展 Band Broadening 由于縱向擴散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象,色譜圖 參數(shù)基本概念,死時間，t0 Dead time 不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間 保留時間，tR Retention time 組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間 死體積，V0 Dead volume 不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積 保留體積，VR Retention volume 組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積,色譜圖 參數(shù)基本概念,在結(jié)果中，選擇圖譜點打印，報告打印時，選擇設(shè)定好的報告模式，或者選擇 “缺醒單個報告”模式打印，在待打印的模式下可以編輯報告顯示的信息，比如表頭，色譜圖的顯示范圍，表格中所需內(nèi)容等。,報告打印,關(guān) 機,數(shù)據(jù)采集完畢后，關(guān)閉檢測器電源開關(guān)，以節(jié)省使用壽命。 使用完畢，按規(guī)定用適當(dāng)?shù)娜軇_洗色譜柱、系統(tǒng)管路、自動進(jìn)樣器、進(jìn)樣針和柱塞桿密封墊，確保 2695 分離單元已徹底沖洗干凈后，關(guān)閉電源開關(guān)。 處理數(shù)據(jù)并打印報告后，關(guān)閉計算機和打印機電源開關(guān)，并做使用登記。,HPLC使用常見注意事項,1.夏季氣溫高，水容易生菌，要求HPLC所用重蒸水必須每天都要更新。 2.柱壓變動范圍較大，處理方法：多為進(jìn)氣泡。高低流速交替沖洗。 3. 配制的流動相使用前要脫氣，常用超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果一般，但比較方便。 4.使用緩沖溶液時，做完樣品后應(yīng)立即用甲醇水溶液