異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中整合素5 的表達(dá)及其性激素調(diào)控【關(guān)鍵詞】 異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞 Abstract:Objective To investigate how asthmatic patients handle metered dose inhaler（MDI）and turbuhaler.Method Asthmatic patients having used MDI and turbuhaler for sometime were investigated，who demonstrated the using of MDI or turbuhaler2-3times，just as the way they used at home or community.After careful observation，their mistakes were found out and recorded，individual health education and instruction of using MDI and turbuhaler were given.Results The rate of correct use of MDI was12.8%（19.149）.The rate of correct using of turbuhaler was41.5%（17.41）.After health education and skill training，they respectively went up to81.9%（122.149）and87.8%（36.41）.Conclusion At present health edu-cation and management of asthma is still weak.It is an important component element to raise asthma control rate.Key words:asthma;metered dose inhaler;turbuhaler;inhaling-therapy;health education 摘要目的: 探討異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中整合素5 的表達(dá)及性激素對(duì)其的影響。 方法: 對(duì)18例卵巢子宮內(nèi)膜異位癥（EM）患者的異位子宮內(nèi)膜組織行體外細(xì)胞培養(yǎng)并傳代。傳代培養(yǎng)中細(xì)胞分為非藥物干預(yù)組（對(duì)照組）、雌二醇（E2 ）組、安宮黃體酮（P）組、米非司酮（RU486）組、三苯氧胺（TAM）組5組，細(xì)胞收獲后用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞組中整合素5 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果: 整合素5 在E2 組及P組的表達(dá)水平分別為1.4150.286及1.3040.170，與對(duì)照組的1.0820.069相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而TAM組及RU486組中整合素5 表達(dá)水平（分別為0.8820.013及1.3040.170）明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論: 整合素5 表達(dá)受雌、孕激素調(diào)控，E2 、P可能通過上調(diào)整合素5 的表達(dá)而促進(jìn)EM粘附的發(fā)生，TAM、RU486可能通過拮抗E2 、P或抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌整合素 5 分子而延緩EM的發(fā)展，從而起到治療作用。 關(guān)鍵詞 異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng);整合素5 ;逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng);性激素 子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究證據(jù)較多的仍為子宮內(nèi)膜種植學(xué)說，同時(shí)EM也是一種性激素依賴性疾病。研究表明，整合素分子在EM的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。為探討整合素5 在EM發(fā)病中的作用，作者進(jìn)行了異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)并予藥物干預(yù)，用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)（RT.PCR）技術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞組中整合素5 mRNA的表達(dá)，了解整合素5 在EM異位內(nèi)膜中的表達(dá)情況及性激素對(duì)其的調(diào)控作用。 1 對(duì)象與方法 1.1 研究對(duì)象 2003年9月至2004年4月間在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院婦產(chǎn)科和南京市鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科，因卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫行腹腔鏡手術(shù)或剖腹手術(shù)的患者18例，年齡2342歲，平均（36.62.4）歲，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)均未用EM治療藥物或激素類藥物，術(shù)后病理組織學(xué)檢查均證實(shí)為卵巢EM。手術(shù)均在排卵前進(jìn)行。 1.2 方法 1.2.1 標(biāo)本收集處理 手術(shù)剝除卵巢囊腫后，在無菌條件下取新鮮囊腫囊壁組織，大小約4cm4cm，將所取標(biāo)本置入4、無菌、含青霉素及鏈霉素的D.Hank 液的取樣瓶中，立即送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。 1.2.2 原代細(xì)胞培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)1，2方法進(jìn)行異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的11DMEM.F12 ，置于37、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每23d換液1次。于光鏡下觀察原代細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。 1.2.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)及分組 原代細(xì)胞全部或大部分融合后用0.125%胰蛋白酶消化傳代，3d細(xì)胞開始融合時(shí)分為5組。（1）對(duì)照組:即非藥物干預(yù)組，單純DMEM.F12 培養(yǎng)液培養(yǎng);（2）雌二醇（E2 ）組:含10nmol・L-1 17.E2 的DMEM.F12 培養(yǎng)液培養(yǎng);（3）安宮黃體酮（P）組:含100nmol・L-1 P的DMEM.F12 培養(yǎng)液培養(yǎng);（4）米非司酮（RU486）組:含1000nmol・L-1 RU486的DMEM.F12 培養(yǎng)液培養(yǎng);（5）三苯氧胺（TAM）組:含1000nmol・L-1 TAM的DMEM.F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)67d，至細(xì)胞基本長(zhǎng)滿瓶底時(shí)開始收獲。 1.2.4 異位內(nèi)膜細(xì)胞中整合素5 表達(dá)的檢測(cè) （1）各細(xì)胞組中總RNA的提取及鑒定:總RNA提取試劑Trizol購自美國(guó)Gibco公司，嚴(yán)格按說明書操作。測(cè)定260nm和280nm波長(zhǎng)處的吸光度（A），A260 .A280 值在1.72.0范圍內(nèi)。（2）引物設(shè)計(jì)及內(nèi)參建立:引物序列參考文獻(xiàn)3，4，經(jīng)對(duì)人類基因庫掃描未發(fā)現(xiàn)其它同源序列。整合素5 及內(nèi)參2 .微球蛋白（2 .MG）引物由上海捷倍思生物工程公司合成。整合素5 序列:5.CATTTCCGAGTCTGGGCCAA.3，5.TGGAGGCTT GAGCTGAGCTT.3，堿基對(duì)長(zhǎng)320bp;2 .MG序列:5.CCACTGAAAAAGATGAGTAT.3，5.CTTCAACCTCCA GATGCTG.3，堿基對(duì)長(zhǎng)120bp。（3）RT.PCR條件:采用兩步法，RNA酶抑制劑、單克隆鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（M.MLV）及Taq酶均購自上海生工生物工程公司。先行RT，反應(yīng)體系25l，PCR儀上42轉(zhuǎn)錄60min，955min滅活M.MLV，立即冰浴冷卻。PCR反應(yīng)體系50l，反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)3，4并加以改進(jìn)。（4）PCR產(chǎn)物測(cè)定:PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.7%瓊脂糖凝膠電泳，80V40min，凝膠掃描圖像分析系統(tǒng)攝像并分析各目的條帶灰度值（OD1 ）。以2 .MG灰度值（OD2 ）為對(duì)照，計(jì)算PCR產(chǎn)物相對(duì)量，用OD1 .OD2 值代表整合素5 mRNA的表達(dá)水平。 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以xs表示，應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示有顯著性差異。 2 結(jié) 果 2.1 體外培養(yǎng)的異位內(nèi)膜細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn) 原代培養(yǎng)的子宮異位內(nèi)膜細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，腺上皮細(xì)胞呈插入性生長(zhǎng)，細(xì)胞為星形、多角形。接種3d后，細(xì)胞呈旋渦狀緊密排列，成團(tuán)生長(zhǎng)，胞質(zhì)呈顆粒狀，核圓而大，核仁明顯;間質(zhì)細(xì)胞則呈伸展、挺直狀，核圓居中。 2.2 異位內(nèi)膜細(xì)胞各組整合素5 mRNA表達(dá)水平各組反應(yīng)物均有相應(yīng)的擴(kuò)增帶:整合素5 320bp，2 .MG120bp（圖1）。各組OD1 .OD2 值見表1，各藥物干預(yù)組與對(duì)照組比較均具有顯著差異（均為P<0.05），但E2 組與P組間、RU486組與TAM組間無顯著差異（P>0.05）。 表1 各細(xì)胞組中整合素5（略）3 討 論 3.1 整合素與EM的關(guān)系 整合素是一類廣泛分布于細(xì)胞表面、連接細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及傳導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間信號(hào)的粘附分子受體，由、亞單位通過非共價(jià)鍵連接組成的異二聚體。目前已發(fā)現(xiàn)至少有18種亞單位和8種亞單位，組合成20多種整合素分子，其主要M為Marker;15依次為E2 組、P組、RU486組、TAM組及對(duì)照組功能是粘附和信號(hào)傳導(dǎo)。有研究提示，異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)及其與周圍盆腔腹膜形成粘連有賴于整合素與基質(zhì)間的相互作用5 。整合素在細(xì)胞的侵襲和種植過程中起著至關(guān)重要的作用，它不僅連接細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，而且通過信號(hào)傳遞和接收來調(diào)整此過程的發(fā)生6 。Beliard等7 研究了18例因疼痛和不孕行腹腔鏡手術(shù)的EM患者子宮內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的整合素表達(dá)，發(fā)現(xiàn)整合素4 1 、5 1 表達(dá)有明顯特異性，且5 在位內(nèi)膜腺體無表達(dá)，而異位內(nèi)膜則持續(xù)表達(dá)，在位內(nèi)膜增殖期缺乏4 ，而異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基底細(xì)胞均表達(dá)4 ，提示4 1 、 5 1 有增加細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用，使得腺上皮細(xì)胞深入到基質(zhì)結(jié)構(gòu)中，與異位內(nèi)膜粘附有關(guān)。國(guó)內(nèi)杭愛國(guó)等8 用免疫組織化學(xué)方法分析了EM患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中整合素4 、5 、1 、 3 的表達(dá)，結(jié)果提示，5 在EM在位內(nèi)膜的表達(dá)顯著低于正常子宮內(nèi)膜。本研究顯示整合素5 在體外培養(yǎng)的異位內(nèi)膜細(xì)胞中均有表達(dá)，說明整合素5 與EM的發(fā)生確實(shí)有一定關(guān)系。 3.2 性激素對(duì)異位內(nèi)膜細(xì)胞中整合素 5 表達(dá)的調(diào)節(jié) Yoshimura等9 體外試驗(yàn)表明，加E2 和P到培養(yǎng)的人體增殖期子宮內(nèi)膜可使子宮內(nèi)膜整合素1 表達(dá)增強(qiáng)。國(guó)內(nèi)也有研究表明，孕三烯酮和RU486對(duì)異位內(nèi)膜細(xì)胞有抑制作用，兩者均可誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡10 。本研究結(jié)果顯示，E2 和P能上調(diào)整合素5 mR-NA表達(dá)，而雌激素拮抗劑TAM、孕激素拮抗劑RU486則降低整合素5 mRNA表達(dá)水平，提示雌、孕激素可能通過改變異位內(nèi)膜細(xì)胞中整合素分子水平而促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞與盆底腹膜間質(zhì)細(xì)胞間的粘附作用，從而促使異位病灶的形成及發(fā)展，而TAM、RU486則可能通過拮抗E2 、P或抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌整合素5 分子而延緩EM的發(fā)展，從而起到治療作用。從另一方面也說明EM的發(fā)生與盆腹腔局部環(huán)境的雌、孕激素水平有關(guān)。 總之，整合素5 在EM的發(fā)生中起著一定作用，抗粘附治療為臨床治療EM提供了一個(gè)新的途徑，有望預(yù)防EM的復(fù)發(fā)和徹底治愈該病。 參考文獻(xiàn) 1MATTHEWS C J，REDFERN C P，HIRST B H，et al.Characteriza-tion of human purified epithelial and stromal cells from endometrium and endometriosis in tissue cultureJ.Fertil Steril，1992，57:990.997. 2鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)M.北京:北京出版社，1995.121.128. 3ADACHI M，TAKI T，HIGASHIYAMA M，et al.Significance of in-tegrin 5 gene expression as a prognostic factor in node-negative non-small cell lung cancerJ.Clin Cancer Res，2000，6（1）:96.101. 4HOSHIGA M，ALPERS C E，SMITH L L，et al. 3 integrin ex-pression in normal and atherosclerotic arteryJ.Circ Res，1995，77（6）:1129.1135. 5STARZINSKI-POWITZ A，HANDRAW-METZMACHER H，KOTZI-AN S.The putative role of cell adhesion molecules in endometrio-sis:can we learn from tumour metastasis?J.Mol Med Today，1999，5:304.309. 6HOOD J D，CHERESH D A.Role of integrin in cell invasion and migrationJ.Nat Rev 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