姜黃素對Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡及ROS影響杜琴，鄧珊，沈克平，胡兵（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，中醫(yī)腫瘤研究所，上海20032）摘要目的：觀察姜黃素對小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞凋亡及活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)水平的影響。方法：不同濃度姜黃素處理Hepa1-6肝癌細(xì)胞，MTT比色法檢測細(xì)胞增殖，Hoechst33258染色檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，WesternBlot法檢測活化型caspase-3，2-7-二氯氫化熒光素乙二脂（DCFH-DA）染色法結(jié)合熒光酶標(biāo)儀檢測姜黃素對胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響。結(jié)果：240mol/L姜黃素作用24h、48h均可抑制肝癌Hepa1-6細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)一定的時間與劑量依賴性。520mol/L姜黃素作用48h后Hepa1-6細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)變化，細(xì)胞凋亡率呈一定程度劑量依賴性，同時可檢測到活化型caspase-3、以及ROS產(chǎn)生。結(jié)論：姜黃素可以抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖，促使Hepa1-6細(xì)胞凋亡，可能與活化caspase-3及提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平相關(guān)。關(guān)鍵詞肝癌；姜黃素；細(xì)胞凋亡；caspase-3；ROSEffectsofCurcuminonROSproductionandapoptosisinMurineHepatocarcinomaHepa1-6CellsDuQin,DengShan,ShenKeping,HuBing（DepartmentofOncologyandInstituteofTraditionalChineseMedicineinOncology,LonghuaHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai,20032）Objective：Toobservetheeffectsofcurcuminonapoptosisandreactiveoxygenspecies(ROS)productioninmurinehepatocarcinomaHepa1-6cellsinvitro.Methods：Hepa1-6cellsweretreatedwithdifferentdoseofcurcumin.CellproliferationwasdetectedwithMTTassay.Apoptoticmorphologywasvisualizedbyhoechst33258staining.Cellapoptosiswasdetectedbyflowcytometryanalysis.Caspase-3wasdetectedbywesternblot.IntracellularROSproductionwasdetectedby2,7-dichlorofluorescindiacetate(DCFH-DA)staining.Results：Comparedwiththecontrols,upontreatmentwith240mol/Lofcurcuminfor24hto48h,Hepa1-6cellsproliferationwassignificantlyinhibitedinatimeanddosedependentmanner.520mol/LofcurcuminalsoinducedapoptosisandapoptoticmorphologychangeinHepa1-6cells.Aftertreatmentwith520mol/Lcurcumin,caspase-3wasactivatedaccompaniedbygenerationofROS.Conclusion：Curcuminmayinhibitcellproliferation,induceapoptosisinmurinehepatocarcinomaHepa1-6cells,andmayinvolvementofcaspase-3activationandROSproduction.KeyWordsHepatocarcinoma；Curcumin；Apoptosis；Caspases-3；Reactiveoxygenspecies姜黃素（Curcumin)是從姜科植物姜黃、郁金等根莖中提取的一種有效組分，具有抗炎、抗突變及抗腫瘤等作用1，已證實姜黃素可抑制乳腺癌、肺癌及胃腸道腫瘤等多種腫瘤細(xì)胞基金資助：上海市基礎(chǔ)研究重點項目（09JC1413600）；龍華醫(yī)院國家中醫(yī)臨床研究基地“龍醫(yī)團隊、龍醫(yī)學(xué)者”項目（LYTD-04）。通訊作者：胡兵（1971-），男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師。研究方向：腫瘤生物學(xué)、功能基因組與抗癌中藥作用及配伍E-mail:生長24，本研究在Hepa1-6細(xì)胞模型中觀察了姜黃素對肝癌細(xì)胞的作用及可能機制。1材料與方法1.1試驗用藥姜黃素（Curcumin）購于sigma（Cat.C7727-100MG，純度94%），用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10mmol/L儲備液，0.22m濾器過濾除菌，-20保存?zhèn)溆谩嶒炃坝肈MEM稀釋成工作液，DMSO終濃度0.1%。1.2細(xì)胞株小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青、鏈霉素各100U/ml）中，37，5%CO2飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。1.3試劑MTT（美國Amresco產(chǎn)品），DMEM高糖培養(yǎng)基（ThermoFisher產(chǎn)品），胎牛血清（SAFCBiosciences公司），caspase-3、-Tubulin抗體（CellSignalingTechnology公司），AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司），細(xì)胞凋亡熒光Hoechst33258檢測試劑盒（南京凱基生物），活性氧檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），其他試劑均為分析純。1.4儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國NAPCO-5410型），酶標(biāo)儀（美國ThermoVarioskan），倒置顯微鏡(日本NikonDXM1200)，流式細(xì)胞儀(美國BDcalibur公司)，電泳和轉(zhuǎn)膜裝置（美國BIO-RAD公司），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描儀（美國LI-COR）。1.5方法1.5.1細(xì)胞增殖檢測取對數(shù)生長期Hepa1-6細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化、計數(shù)，按3103/100L/孔接種于96孔板中，過夜貼壁后實驗組加入不同濃度姜黃素（2mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L），對照組加入等體積DMSO，空白組不做處理。每組3個復(fù)孔；分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h每孔加入新鮮配制的濃度為5mg/mL的MTT溶液20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO150l，輕輕振蕩10min，用酶標(biāo)儀于490nm處檢測各孔光密度值(opticaldensity，OD)值，按公式計算細(xì)胞存活率：存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）100%。細(xì)胞實驗重復(fù)3次。1.5.2細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察常規(guī)消化、接種Hepa1-6細(xì)胞于24孔板，貼壁24小時后加入終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素干預(yù)Hepa1-6細(xì)胞，對照組加入等體積DMSO，48h后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入4%甲醛溶液，4固定10min，PBS洗滌2次，滴加Hoechst33258熒光染色液100L，室溫染色10min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并隨機拍照。1.5.3流式細(xì)胞儀檢測收集終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用后細(xì)胞，PBS洗滌三次，調(diào)細(xì)胞濃度3105/ml，4，1500rpm，離心5min，加入100L結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入0.5LAnnexinV-FITC混勻后，加入5LPI混勻，室溫、避光、反應(yīng)10min，上機，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。1.5.4ROS活性檢測終濃度為5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用Hepa1-6細(xì)胞48h后，更換含DCF-DA10mol/L無血清DMEM培養(yǎng)液，37孵育20min后，棄培養(yǎng)液，無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，鏡下觀察；同時收獲細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度2106/mL，黑色96孔板每孔100L細(xì)胞懸液，每組設(shè)3復(fù)孔，熒光酶標(biāo)儀測DCFOD值，488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波。1.5.5Westernblot收集藥物作用后Hepa1-6細(xì)胞，常規(guī)裂解，離心去除DNA，加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液100變性15min，用10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉1h后，加入Caspase-3或-Tubulin抗體4孵育過夜，PBST洗膜后與熒光標(biāo)記二抗（1:2500）37孵育1h，PBST反復(fù)洗滌34次后Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描圖像入計算機。1.6統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以xs表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異比較采用單向方差分析，按=0.05的檢驗水準(zhǔn)，P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞增殖作用MTT實驗結(jié)果顯示，240mol/L姜黃素可以不同程度地抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖，濃度在5mol/L或以上與對照組比較，差異顯著（P0.05），并隨姜黃素濃度增加和作用時間延長抑制作用明顯增強。見表1。表1姜黃素對Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖影響(xs，n=3)組別劑量（mol/L）存活率（%）24h48h對照組0100.002.12100.001.93姜黃素296.343.8195.424.47姜黃素591.170.59*87.711.57*姜黃素1087.022.45*82.960.05*姜黃素2079.882.21*62.572.98*姜黃素4042.010.81*13.381.39*注：與對照組比較，：*P0.05,*P0.012.2姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察研究采用Hoechst33258染色觀察姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響，結(jié)果如圖1所示，對照組Hepa1-6細(xì)胞呈弱熒光染色，不同濃度姜黃素作用后Hepa1-6細(xì)胞可以吸收Hoechst33258，發(fā)出較強烈的藍色熒光，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的藍色熒光顆粒，染色質(zhì)凝聚、邊緣化及細(xì)胞核裂解等凋亡細(xì)胞核形態(tài)。見圖1。圖1姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞凋亡形態(tài)影響（100）2.3姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞凋亡率影響AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測顯示，終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用48h，Hepa1-6細(xì)胞凋亡率分別為（6.031.08）%、（11.390.24）%、（16.550.94）%，其中10mol/L、20mol/L組細(xì)胞凋亡率與對照組比較有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。見圖2。Cur10mol/LControlCur5mol/LCur20mol/LControlCur5mol/LCur10mol/LCur20mol/L圖2姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞凋亡影響2.4姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞內(nèi)ROS影響DCFH-DA熒光染色后，姜黃素組細(xì)胞可見綠色熒光，ROS熒光強度隨姜黃素濃度增加而增強，熒光酶標(biāo)儀檢測顯示終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用后ROS熒光強度分別為對照組1.21、2.09、11.73倍（P0.05）。見圖3。圖3姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞ROS影響（100）2.5Caspase-3活化蛋白的表達Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵執(zhí)行分子，caspase-3以酶原形式存在于胞漿中，在細(xì)胞凋亡早期階段，caspase-3被激活剪切后產(chǎn)生的17kD和12kD片斷，Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)5、10、20mol/L姜黃素作用48h后可以檢測到caspase-317kD產(chǎn)物，提示姜黃素可以活化caspase-3，見圖4。圖4姜黃素對Hepa1-6細(xì)胞caspase-3活化作用3討論原發(fā)性肝癌（簡稱肝癌）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第7位，我國及東南亞國家發(fā)病率尤高，預(yù)后極差，5年生存率為3%5%5,6。肝癌隱匿，進展迅速，大多肝癌患者就診時已失去手術(shù)機會，同時由于肝癌對放射及細(xì)胞毒性藥物治療不敏感或因肝功能異常不能耐受常規(guī)治療，亟待尋找高效、低毒的新的治療手段。目前國內(nèi)外多項研究已證實，姜黃素可通過抑制微管的動態(tài)不穩(wěn)定性、激活有絲分裂點、誘導(dǎo)凋亡及阻滯細(xì)胞周期等多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞生長2,7，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素對Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，提示姜黃素對肝癌細(xì)胞具有一定程度抗癌作用。細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡（Programmedcelldeath），是細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，受內(nèi)在基因調(diào)控的自動結(jié)束生命的過程，是腫瘤藥物治療主要效應(yīng)機制之一；凋亡細(xì)胞可以呈現(xiàn)特殊的形態(tài)學(xué)改變，如染色質(zhì)濃縮、凝聚，細(xì)胞核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體等8。本研Cur20mol/LCur10mol/LCur5mol/LControl-TubulinCleavedcaspase-3Curcumin(mol/L)020105究顯示姜黃素作用后Hepa1-6細(xì)胞可吸收Hoechst33258，發(fā)出強烈的藍色熒光，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的藍色熒光顆粒及明顯核形態(tài)變化；同時AnnexinV-FITC/PI，流式細(xì)胞儀檢測顯示不同濃度姜黃素作用后Hepa1-6細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，提示姜黃素可誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡可能參與姜黃素抗肝癌作用。caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白酶，正常情況下，caspase-3以酶原形式存在于胞漿中，在細(xì)胞凋亡過程中，多種凋亡信號最終引起caspase-3活化，被剪切后產(chǎn)生的17kD和12kD片斷，進而裂解下游蛋白底物，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，因此，細(xì)胞凋亡研究常以檢測caspase-3活化產(chǎn)生的17kD產(chǎn)物的形式來鑒定其活化8,9。本研究結(jié)果顯示姜黃素作用后Hepa1-6細(xì)胞可以檢測到caspase-3剪切產(chǎn)生17kD產(chǎn)物，提示姜黃素可以活化caspase-3，參與誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞凋亡。目前研究廣泛地證實ROS與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長抑制之間有密切關(guān)系，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化可以引起腫瘤細(xì)胞一系列與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)信號通路的變化，如NF-B、ASK1/JNK等信號通路，活化caspase-3；ROS產(chǎn)生先于caspase-3的活化，提高結(jié)腸癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平能抑制癌細(xì)胞生長1014。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素可以顯著提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提示ROS可能參與姜黃素誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞生長抑制及細(xì)胞凋亡，具體的凋亡信號通路有待進一步研究。參考文獻1.GodA,KunnumakkaraAB,AggarwalBB.CurcuminasCurecuminFromkitchentoclinic.BiochemicalPharmaeo,2008；5(4):7878092.BanerjeeM,SinghP,PandaD.Curcuminsuppressesthedynamicinstabilityofmicrotubules,activatesthemitoticcheckpointandinducesapoptosisinMCF-7cells.FEBSJ,2010；277(16):343734483.SahaA,KuzuharaT,EchigoN,eta1.Apoptosisofhumanlungcancercellsbycurcuminmediatedthroughup-regulationofgrowtharrestandDNAdamageinduciblegenes45and153.BiolPharmBull,2010；33(8):129112994.PatelBB,GuptaD,ElliottAA,eta1.CurcumintargetsFOLFOX-survivingcoloncancercellsviainhibitionofEGFRsandIGF-1R.AnticancerRes,2010；30(2):319325.5.JemalA,BrayF,CenterMM,eta1.Globalcancerstatistics(2011).CACancerJClin,2011；61(2):69906.HagymsiK,TulassayZ.Epidemiologyriskfactorsandmolecularpathogenesisofprimarylivercancer.OrvHetil,2008；149(12):5415487.TeitenMH,GaaschtF,CronauerM,eta1.Anti-proliferativepotentialofcurcumininandrogen-dependentprostatecancercellsoccursthroughmodulationoftheWinglesssignalingpathway.IntJOncol,2010；38(3):6036118.deBruinEC,MedemaJP.Apoptosisandnon-apoptoticdeathsincancerdevel