咪達(dá)唑侖對新生大鼠離體脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的作用*宦才娟，汪萌芽*（皖南醫(yī)學(xué)院細(xì)胞電生理研究室，安徽蕪湖241002）EffectsofmidazolamonmotoneuronsinneonatalratspinalcordinvitroHUANCai-juan,WANGMeng-ya*CellElectrophysiologyLaboratory,WannanMedicalCollege,Wuhu,Anhui241002,ChinaAbstractObjective:Toobservetheeffectsofmidazolamonmotoneurons(MNs)inneonatalratspinalcordslices.Methods:TheconventionalintracellularrecordingtechniqueswereusedtoobservetheeffectsofmidazolamatdistinctconcentrationonMNsofspinalcordslicesisolatedfromneonatalrats(814dold).Results:Inthe5MNssteadilyrecorded,notonlyadepolarizationresponseof(18.210.8)mVwithincreaseofmembraneresistancewasinducedbyperfusionofmidazolamat0.1-1.0mmol/Lfor15minofeachconcentration(Sx,P0.05orP0.01),butalsoamplitudeofactionpotentialswasdecreased(P0.05),andevenactionpotentialswerenullifiedin2MNs.In4MNswithdorsalrootletstimulation-evokedexcitatorypostsynapticpotentials(DR-EPSPs),bathofmidazolam(0.1-1.0mmol/L)reversiblydepressedDR-EPSPsinaconcentration-dependentmanner.Moreover,in3MNswithDR-EPSPfollowedbyinhibitorypostsynapticpotentials(DR-IPSPs),DR-EPSPswereinhibitedandDR-IPSPswereenhancedbymidazolamatlowconcentration,whereasbothofthemwerenullifiedathighconcentration.Conclusion:Thefindingssuggestthatmidazolammayreversiblyandconcentration-dependentlyinhibittheMNexcitabilityanditssynaptictransmissionfromsensoryinputs.Keywords:spinalcord；motoneuron；synaptictransmission；midazolam；electrophysiology摘要目的:觀察咪達(dá)唑侖對新生大鼠離體脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（MN）的作用。方法:采用常規(guī)細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù)，觀察不同濃度的咪達(dá)唑侖對新生大鼠（814d）離體脊髓MN的作用。結(jié)果:在5個(gè)記錄穩(wěn)定的MN，累積灌流0.11.0mmol/L咪達(dá)唑侖各15min，不僅產(chǎn)生可逆的、濃度依賴性去極化反應(yīng)(P0.05或P0.01)，并伴有膜電阻的增大(P0.05)，而且抑制動(dòng)作電位的幅度和發(fā)放頻率(P0.05)，且1.0mmol/L的咪達(dá)唑侖在其中2個(gè)MN完全取消動(dòng)作電位的產(chǎn)生。在4個(gè)記錄到背根刺激誘發(fā)出興奮性突觸后電位（DR-EPSP）的MN，0.11.0mmol/L咪達(dá)唑侖累積灌流各15min，亦呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用，其中0.1mmol/L的咪達(dá)唑侖對DR-EPSP抑制性作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3,P0.05)。而在記錄到DR-EPSP合并有抑制性突觸后電位（DR-IPSP）的3個(gè)MN，低濃度咪達(dá)唑侖抑制DR-EPSP而增大DR-IPSP，但高濃度亦完全取消DR-IPSP。結(jié)論:咪達(dá)唑侖對脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性及其外周傳入性突觸傳遞具有濃度依賴性抑制作用。關(guān)鍵詞脊髓；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；突觸傳遞；咪達(dá)唑侖；電生理學(xué)咪達(dá)唑侖(Midazolam)是當(dāng)前臨床使用的唯一水溶性苯二氮艸卓(BZ)類藥,依劑量的不同而具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、抗驚厥、抗癲癇及中樞肌松等作用1。咪達(dá)唑侖具有起效快、蘇醒快,對呼吸和循環(huán)功能干擾少,安全有效等特點(diǎn),是較理想的靜脈麻醉藥,有廣泛的應(yīng)用前景2。盡管臨床觀察發(fā)現(xiàn)靜脈注射咪達(dá)唑侖顯示鎮(zhèn)痛作用3，但有關(guān)咪達(dá)唑侖鎮(zhèn)痛作用中是否涉及對脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（motoneuron,MN）的影響,目前國內(nèi)外尚未見研究報(bào)道。本文應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù),觀察咪達(dá)唑侖對新生大鼠脊髓切片MN的作用。1材料與方法1.1新生大鼠脊髓切片的制備取814d齡新生SD大鼠(雌雄不拘，由南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場提供),參照報(bào)道方法4,經(jīng)乙醚麻醉后行椎板切除術(shù),分離出含腰骶膨大的脊髓節(jié)段后,將脊髓用膠水(crazyglue)固定在瓊脂塊上,再將瓊脂塊固定于振蕩切片機(jī)(Vibratome)的冰浴載物浴碟內(nèi),用剃須刀片橫向切取厚度為400500m的脊髓切片若干,在室溫下置于用混合氣體(95O2+5CO2)飽和的人工腦脊液(ACSF)中孵育、備用。在制備脊髓切片過程中，用04并經(jīng)混合氣體飽和的ACSF浸浴離體的脊髓節(jié)段，整個(gè)過程控制在15min以內(nèi)。ACSF的成分為(mmol/L):NaC1127.0,KC11.9,KH2PO41.2,CaC122.4,MgSO47H2O1.3,NaHCO326.0,GlucoseH2O10.0,pH7.4。基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（090413084)作者簡介：宦才娟（1981-），女，2008級碩士研究生，(電話(電子郵箱)；汪萌芽，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，*通訊作者（E-mail:）1.2新生大鼠脊髓MN的細(xì)胞內(nèi)記錄新生大鼠脊髓切片于室溫下孵育4060min后，用吸管移入自制的全浸式記錄浴槽，用上、下兩個(gè)絲網(wǎng)相夾固定，持續(xù)灌流經(jīng)混合氣體飽和的ACSF，浴槽中灌流液的溫度為室溫(2225)。用P-97程控微電極拉制儀(SutterInstrumentCo.,USA)拉制含纖維玻璃微電極，內(nèi)充3mol/L乙酸鉀，固定于微操縱儀(MP-1，Narishige，Japan)上，將探頭(headstage)上的銀絲插入電極尾端內(nèi)，用于胞內(nèi)電流注入及電位記錄。選用尖端阻抗為70120M的微電極，在體視顯微鏡下經(jīng)微操縱儀對脊髓切片中腹角MN區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞穿刺。緩慢手動(dòng)推進(jìn)微電極，當(dāng)微電極壓在細(xì)胞膜上時(shí)，通過Axoclamp-2B微電極放大器(AxonInstrumentInc.,USA)的附設(shè)遙控裝置(Buzz)進(jìn)行觸發(fā)，引發(fā)電極尖端的電磁振蕩可使微電極刺入細(xì)胞內(nèi)。記錄到的膜電位信號(hào)經(jīng)微電極放大器用橋平衡模式進(jìn)行放大，橋平衡模式可經(jīng)同一電極同時(shí)進(jìn)行膜電位記錄和電流注入。放大的膜電位信號(hào)經(jīng)Digidata1200接口(AxonInstrumentInc.,USA)輸入計(jì)算機(jī)，用pClamp7.0軟件(AxonInstrumentsInc.,USA)進(jìn)行采樣、記錄并保存。1.3電刺激方法細(xì)胞內(nèi)電流注射：在微機(jī)內(nèi)由pClamp7.0軟件（AxonInstrumentsInc.,USA）程序設(shè)定，由微機(jī)觸發(fā)，信號(hào)經(jīng)Digidata1200聯(lián)機(jī)接口輸入微電極放大器后，刺激電流由探頭輸出經(jīng)微電極注入細(xì)胞內(nèi)。腹外側(cè)索（VLF）、背根（DR）及腹根（VR）電刺激：由三通道電刺激器(NihonKohden,Japan)產(chǎn)生的方波脈沖分別經(jīng)刺激器中一個(gè)通道輸出，經(jīng)隔離器(NihonKohden,Japan)以恒壓模式至同芯雙極刺激電極(FrederickHaer&Co.,USA)。刺激電極尖端放置到脊髓切片的腹外側(cè)索區(qū)、背根和腹根殘端上，用于激活下行、背根傳入和腹根纖維。1.4給藥方法咪達(dá)唑侖注射液(徐州恩華藥業(yè)有限公司)，實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)用ACSF配制成所需濃度0.1,0.3,1.0mmol/L，由恒流泵灌流給藥，全程用混合氣體飽和，灌流用藥的前后條件（如灌流的速度與溫度等）保持一致。每種濃度灌流15min，最后用ACSF洗脫。1.5分析方法記錄到的資料，用pClamp8.0中的Clampfit8.1軟件（AxonInstrumentsInc.,USA）進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)分析用Origin5.0軟件。數(shù)據(jù)以Sx表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)采用配對t檢驗(yàn)，P0.05為有顯著性意義。2結(jié)果選取靜息電位(restingpotential，RP)負(fù)于60mV且動(dòng)作電位有超射，記錄穩(wěn)定的細(xì)胞，通過加在腹根殘端上的同芯雙極刺激電極進(jìn)行逆行激活鑒定，若記錄到具有全或無特點(diǎn)的動(dòng)作電位(逆行AP)或碰撞試驗(yàn)陽性，即鑒定為MN，并進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)和分析。2.1咪達(dá)唑侖對MN電學(xué)特性的影響在5個(gè)MN,給于0.11.0mmol/L的咪達(dá)唑侖累積灌流每一濃度各15min，觀察用藥前后膜電生理參數(shù)，結(jié)果見表1?？梢娺溥_(dá)唑侖產(chǎn)生濃度依賴性去極化作用（配對t測驗(yàn)，P0.05或P0.01），在0.3mmol/L濃度作用時(shí)斜率電阻的增大有顯著性意義（n=5,P0.05），作用可逆。表1咪達(dá)唑侖對MN電生理參數(shù)的影響（Sx，n=5）Tab1EffectsofmidazolamonelectrophysiologicalpropertiesofneonatalratspinalcordMNsinvitro.(Sx,n=5)Control(n=5)Midazolam(mmol/L)0.1(n=4)0.3(n=5)1.0(n=2)RP(mV).71.19.453.213.0*47.810.7*36.08.5Rm(M).9.758.011.0*61.02.5(ms)11.53.914.76.714.84.014.67.3ActionpotentialAmp(mV)15.552.415.7#TL(mV)5312.340.711.335.31.9#OS(mV)14.67.427.27.0#SpikepotentialAmp(mV)59.87.954.814.7*3834.8*#Half-width.(ms)#MaxL.slope(mV/ms)130.937.8101.954.9*141.752.4#MaxR.slope(mV/ms)69.728.763.227.053.420.0#RiseTime(ms)#DecayTime(ms)#與對照組比較:*P0.05，*P0.01，#完全取消2.2咪達(dá)唑侖對MN動(dòng)作電位的影響對5個(gè)誘發(fā)出動(dòng)作電位的MN，給予0.11.0mmol/L的咪達(dá)唑侖累積灌流各15min，結(jié)果顯示動(dòng)作電位的幅度和超射值隨著濃度的增加而逐漸降低，1.0mmol/L的咪達(dá)唑侖完全取消了動(dòng)作電位的發(fā)放（表1，圖1）。0.3nA0.3nA0.3nA0.3nAControlMidazolam(mmol/L)0.31.0Wash40mV6mS圖1咪達(dá)唑侖可逆性并濃度依賴性抑制MN的動(dòng)作電位Fig1Reversiblyandconcentration-dependentinhibitoryactionofmidazolamonactionpotentialinaMNinvitro.RPwas73mV.2.3咪達(dá)唑侖對MN動(dòng)作電位發(fā)放頻率的影響對實(shí)驗(yàn)中記錄到的MN給予不同強(qiáng)度（+0.1+1.3nA，300ms）的細(xì)胞內(nèi)去極化脈沖，大部分MN的放電頻率呈現(xiàn)與電流強(qiáng)度相關(guān)性升高（I-F關(guān)系曲線），對于其中5個(gè)MN給予0.1,0.3mmol/L咪達(dá)唑侖灌流，觀察到MN的I-F關(guān)系曲線右移、斜率降低（圖2），其中0.3mmol/L咪達(dá)唑侖對0.20.6nA時(shí)的放電頻率抑制有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=5，P0.05），說明咪達(dá)唑侖濃度依賴性抑制MN的動(dòng)作電位發(fā)放頻率。05101520253035400Control0.1mmol/L0.3mmol/Ln=5n=4n=5F(Hz)I(nA)ControlMidazolam(mmol/L)0.10.3Wash0.8nA0.8nA0.8nA20mS40mV0.8nAAB圖2咪達(dá)唑侖對MN動(dòng)作電位發(fā)放頻率的影響A:咪達(dá)唑侖濃度依賴性抑制動(dòng)作電位發(fā)放頻率的實(shí)驗(yàn)記錄，左側(cè)數(shù)字表示濃度，右側(cè)數(shù)字表示誘發(fā)動(dòng)作電位的細(xì)胞內(nèi)去極化電流強(qiáng)度，該MN的RP為73mV；B:咪達(dá)唑侖對I-F關(guān)系曲線的影響（Sx）；P0.05Fig2Effectsofmidazolamoncurrentintensity-firingfrequency(I-F)inaMN.A:Concentration-dependentinhibitoryactionsofmidazolamoncurrentintensity-firingfrequency(I-F)relationofMNsinvitro.B:Plottingofspike-firingfrequency(F)vscurrentintensity(I)fromA.RPwas73mV.Pairedttestvscontrol:P0.052.4咪達(dá)唑侖對MN背根興奮性突觸后電位的影響在記錄到背根電刺激誘發(fā)出興奮性突觸后電位（DR-EPSP）的4個(gè)MN，給予0.11.0mmol/L的咪達(dá)唑侖各累積灌流15min，觀察到咪達(dá)唑侖對DR-EPSP呈現(xiàn)可逆性抑制作用（圖3，表2），其中0.1mmol/L的咪達(dá)唑侖的抑制作用有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3,P0.05），并呈濃度依賴性特征（圖4）。另外，在記錄到DR-EPSP合并抑制性突觸后電位（DR-IPSP）的3個(gè)MN，給予0.11.0mmol/L咪達(dá)唑侖各累積灌流15min，隨著濃度增大DR-EPSP逐漸被抑制，而DR-IPSP的幅度增大，但在1.0mmol/L濃度DR-IPSP也被完全取消，作用可被ACSF部分洗出。一個(gè)細(xì)胞的典型記錄例示于圖5。表2咪達(dá)唑侖對MNDR-EPSP的影響（Sx，n=4）Tab2EffectsofmidazolamonDR-EPSPofratspinalcordMNsinvitro.(Sx,n=4)Control(n=4)Midazolam(mmol/L)0.1(n=3)0.3(n=2)1.0(n=2)Amplitude(mV).1.8*1.01.4#Areaundercurve(mVms)241.6210.982.0107.236.050.9#Duration(ms)84.751.386.595.439.055.2#Latency(ms)#Half-width(ms)19.08.912.6#MaxL.slope(mV/ms)7.00.81.1#MaxR.slope(mV/ms)-12.313.2-3.32.9-0.91.3#與對照組比較:*P0.05，#完全取消20ms10mVControl0.1WashMidazolam(mmol/L)DR圖3咪達(dá)唑侖（0.1mmol/L）對MNDR-EPSP的可逆性抑制作用箭頭所指為DR電刺激偽跡，該MN的RP為68mV。Fig3Reversibleactionofmidazolam（0.1mmol/L）onDR-EPSPinaMNinvitro.Wash:ACSF.RPwas-68mV.ArrowindicatesDRstimulusartifact.40ms4mVControl5min10min15minDRMidazolam(mmol/L)0.31.05min圖4咪達(dá)唑侖（0.3,1.0mmol/L）濃度依賴性抑制MN的DR-EPSP箭頭所指為DR電刺激偽跡，該MN的RP為73mV。Fig4Concentration-dependentinhibitoryactionofmidazolamonDR-EPSPsinaMNinvitro.RPwas-73mV.ArrowindicatesDRstimulusartifact.Control01.03.10.Midazolam(mmol/L)Wash10ms4mVDR圖5不同濃度咪達(dá)唑侖對MNDR-EPSP復(fù)合DR-IPSP的作用箭頭所指為DR電刺激偽跡，該MN的RP為76mV。Fig5EffectsofmidazolamonDR-EPSPandDR-IPSPinaMNinvitro.RPwas-76mV.ArrowindicatesDRstimulusartifact.3討論本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù)，觀察到咪達(dá)唑侖對新生大鼠脊髓切片MN膜電學(xué)性質(zhì)、動(dòng)作電位和電刺激背根產(chǎn)生的DR-EPSP均具有可逆性抑制作用，這可能與咪達(dá)唑侖增強(qiáng)GABAA受體活性、阻斷Na+通道等作用有關(guān)。咪達(dá)唑侖是臨床上常用的一種苯二氮艸卓類(BZ)靜脈麻醉藥，BZ受體是GABAA受體主要識(shí)別位點(diǎn)之一，位于神經(jīng)元的突觸膜上，與GABAA受體相鄰并偶聯(lián)于共同的Cl-通道。與異丙酚復(fù)合應(yīng)用于手術(shù)病人全身麻醉5，具有良好的鎮(zhèn)靜作用。目前認(rèn)為其麻醉作用的分子機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞膜上離子通道的活性變化有關(guān)6。多年來，-氨基丁酸(GABA)受體及其門控的Cl-通道復(fù)合物一直是全麻機(jī)制的研究焦點(diǎn)。BZ類藥物可與其相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，使受體發(fā)生變構(gòu)，促進(jìn)GABA與低親和力的GABA位點(diǎn)結(jié)合起到增強(qiáng)抑制的效果7。在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用中，有研究8顯示咪達(dá)唑侖與GABAA受體復(fù)合體中的BZ位點(diǎn)結(jié)合數(shù)目越多，其藥理作用也越強(qiáng)，原因可能是咪達(dá)唑侖與BZ受體結(jié)合后增強(qiáng)GABA與GABAA受體結(jié)合，使神經(jīng)元上Cl-通道開放，促使Cl-內(nèi)流，形成神經(jīng)細(xì)胞膜的超極化狀態(tài)，從而減少了神經(jīng)元的興奮性遞質(zhì)的釋放，同時(shí)抑制了腦內(nèi)神經(jīng)突觸對GABA的重?cái)z取。由此可見，本文觀察到咪達(dá)唑侖抑制脊髓MN的DR-EPSP的作用，可能是咪達(dá)唑侖作用于GABAA受體的結(jié)果，特別是在低濃度時(shí)，既抑制DR-EPSP又增強(qiáng)DR-IPSP，提供了直接的證據(jù)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，咪達(dá)唑侖對脊髓MN的膜電生理特性有影響，能引起去極化反應(yīng)，并有抑制AP的幅度的趨勢，同時(shí)對刺激脊髓背根產(chǎn)生的EPSP具有明顯的抑制作用。有關(guān)高濃度咪達(dá)唑侖同時(shí)可取消動(dòng)作電位、DR-EPSP和DR-IPSP的作用，顯然不可能是增強(qiáng)GABAA受體作用所致。已有研究表明臨床濃度的咪達(dá)唑侖對交感神經(jīng)元鈉通道電流具有抑制作用9。也有研究10表明咪達(dá)唑侖對Ca2+和K+通道具有抑制作用。本文觀察到咪達(dá)唑侖對細(xì)胞內(nèi)去極化電流刺激誘發(fā)的動(dòng)作電位具有濃度依賴性抑制作用，在高濃度完全取消動(dòng)作電位的發(fā)放，結(jié)合高濃度咪達(dá)唑侖也完全取消DR-IPSP的作用，表明高濃度咪達(dá)唑侖的作用，至少涉及Na+通道的阻斷作用。咪達(dá)唑侖與異丙酚已經(jīng)被廣泛聯(lián)合運(yùn)用于臨床麻醉中，兩藥聯(lián)合運(yùn)用既可確?；颊弋a(chǎn)生鎮(zhèn)靜遺忘效應(yīng)，又有利于減少各自的用量，降低藥物不良反應(yīng)11，而我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究顯示臨床濃度異丙酚對離體脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有抑制作用，且認(rèn)為高濃度時(shí)通過直接抑制谷氨酸受體而起作用12。結(jié)合本文對咪達(dá)唑侖作用的觀察，提示咪達(dá)唑侖可能在MN靶點(diǎn)上與異丙酚有協(xié)同作用，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1REVESJG,FRAGENRJ,VINIKHR,etal.Midazolam:pharmacologya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