實驗二蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)與等電點測定,1,了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)掌握測定蛋白質(zhì)等電點的方法,實驗?zāi)康?2,P,COOH,NH2,P,COO-,NH3+,P,COO-,NH2,P,COOH,NH3+,pH=pI,pHpI,pHpI,兼性離子,陽離子,陰離子,實驗原理,3,在等電點時蛋白質(zhì)顆粒上的凈電荷為零，缺乏同電相斥的因素，蛋白質(zhì)溶解度最小，最容易析出沉淀,維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素：,表面電荷、水化膜,4,本實驗配制了各種不同pH值的緩沖液，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液pH值即為酪蛋白的等電點,5,實驗器材與試劑,大試管、滴管、刻度吸量管,0.5酪蛋白醋酸鈉溶液,0.01溴甲酚綠指示劑(指示范圍:pH3.8-5.4),0.02MHCL溶液、0.02MNaOH溶液,0.01M醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、1.00M醋酸溶液,6,蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（1）,實驗步驟,取一干凈試管,酪蛋白液10滴,溴甲酚綠指示劑3滴,觀察溶液顏色并解釋現(xiàn)象,7,蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（2）,滴加0.02MHCL溶液,邊滴加邊混勻,有最大沉淀產(chǎn)生，觀察溶液顏色變化,至沉淀消失，觀察溶液顏色并解釋現(xiàn)象,繼續(xù)滴加0.02MHCL溶液,邊滴加邊混勻,8,蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（3）,繼續(xù)滴加0.02MNaOH溶液,邊滴加邊混勻,有最大沉淀產(chǎn)生，觀察溶液顏色變化,至沉淀消失，觀察溶液顏色并解釋現(xiàn)象,繼續(xù)滴加0.02MNaOH溶液,邊滴加邊混勻,9,溶液呈藍(lán)色,蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)(1),實驗結(jié)果,酪蛋白溶液呈堿性(pH5.4)，使溴甲酚綠指示劑顯藍(lán)色,10,H+，沉淀,蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)(2),出現(xiàn)最大量沉淀時,說明到達(dá)了酪蛋白的等電點,溶液由藍(lán)色變成淺綠色（3.8pH5.4）,11,繼續(xù)加酸，H+繼續(xù)增大，pHpI。酪蛋白所帶正電荷不斷增加，同電相斥，沉淀溶解,沉淀完全溶解時，溶液顯黃色(pH3.8),12,OH-，沉淀,蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)(3),出現(xiàn)最大量沉淀時,說明到達(dá)了酪蛋白的等電點,溶液由黃色變成淺綠色（3.8pH5.4）,13,繼續(xù)加堿，OH-繼續(xù)增大，pHpI。酪蛋白所帶負(fù)電荷不斷增加，同電相斥，沉淀溶解,沉淀完全溶解時，溶液顯藍(lán)色(pH5.4),14,結(jié)論1：,酪蛋白的等電點在pH3.8-5.4之間,pH=pI時，蛋白質(zhì)溶解度最小,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),15,取7支同樣規(guī)格的干燥試管，精確加入各試劑,酪蛋白等電點的測定,注：單位均為mL,16,向每個試管中各加0.5%酪蛋白溶液20滴，加一管，立即混勻一管,靜置30分鐘后，以0、+、+、+、+表示各管的混濁度，并指出哪一種pH是酪蛋白的等電點,17,酪蛋白等電點的測定,1,2,3,4,5,6,7,實驗結(jié)果,18,結(jié)論2：,4號試管沉淀量最多,說明4號管溶液的pH值為酪蛋白的等電點，即pI=4.7,什么是蛋白質(zhì)的等電點？在等電點時，蛋白質(zhì)溶液為什么容易發(fā)生沉淀？,思考題,20,實驗項目實驗